BIOTECHNOLOGIA
Wykład 8 21.04.2006
Dla nadprodukcji aminokwasów są 2 ograniczenia: z jednej strony jest to dostarczenie grupy aminowej do odpowiedniej biosyntezy, z drugiej strony jest to biosynteza odpowiedniego szkieletu węglowego. Źródłem grupy aminowej w biosyntezie aminokwasów jest jon amonowy.
Jon amonowy może być pozyskiwany na różne sposoby:
1. wyniku degradacji związków mogących zawierać taką grupę (aminokwasów, zasad purynowych i pirymidynowych, mocznika)
2. poprzez redukcję azotanów i azotynów (niektóre bakterie; azotany i azotyny mogą dostawać się do gleby w wyniku działalności człowieka lub natury /podczas burzy/)
Łańcuchami węglowymi wykorzystywanymi w biosyntezie aminokwasów są ketokwasy (to na ogół ketokwasy przemian centralnych, jak 2-oksoglutaran, szczawiooctan itp.).
Podstawowym mechanizmem włączania jonów amonowych do α-ketokwasów jest włączanie grupy amonowej do 2-oksoglutaranu w wyniku działania dehydrogenazy glutaminianowej jako koenzymu wymagającej NADPH. W wyniku takiej redukcji, prowadzącej dodatkowo do odłączenia cząsteczki wody, powstaje glutaminian. Ta droga funkcjonuje tylko przy wysokim stężeniu jonów amonowych, gdyż enzym katalizujący tę przemianę ma niskie powinowactwo do jonów amonowych.
Istnieje także druga droga włączania jonów amonowych do szkieletów węglowych, może być niezależna od tej pierwszej, a może z nią razem współdziałać. Droga ta funkcjonuje gdy w środowisku jest niskie stężenie jonów amonowych i składa się z 2 etapów:
1. powstawania amidu kwasu glutaminianowego, czyli podstawienie grupą aminową grupy OH w grupie karboksylowej (do tego podstawienia niezbędna jest cząsteczka ATP);
2. następnie ta grupa aminowa może być przeniesiona na 2-oksoglutaran w wyniku działania syntazy glutaminianowej (do tego niezbędne jest NADPH).
Obie te drogi różnią się stężeniem jonów amonowych w środowisku, jak i ilością energii jaką trzeba zużyć na przyłączenie 1 cząsteczki jonu amonowego. Jeżeli obie drogi funkcjonują w organizmie, to musi występować jakaś regulacja tego procesu. Przy niskim stężeniu jonów amonowych przestaje działać pierwsza droga, przy wysokim druga jest praktycznie niepotrzebna (syntetaza L-glutaminianowa jest hamowana wysokim stężeniem jonów amonowych). Gdy w organizmie nie ma pierwszej drogi a pozostała tylko druga, to gdy w środowisku będzie wysokie stężenie jonów amonowych nadprodukcja aminokwasów będzie niemożliwa (pierwszego układu nie ma, a drugi jest wyłączony).
Powinowactwo do jonów amonowych dehydrogenazy glutaminianowej jest znacznie mniejsze niż syntetazy glutaminowej (Km dehydrogenazy > Km syntetazy)
Omówiona droga pozyskiwania jonów amonowych jest drogą główną, ale istnieją też inne. Może to być w wyniku działania liazy fumaranowej katalizującej przyłączanie grupy amonowej do fumaranu (powstaje asparaginian; najpierw przyłączane jest AMP i odłączany pirofosforan); czy też w analogicznej reakcji (ale o innym mechanizmie, tu następuje zużycie ATP; do aminokwasu przyłączana jest najpierw grupa fosforanowa a następnie reszta amidowa) może powstawać asparagina (amid kwasu asparaginowego). Jon amonowy może też być wykorzystywany w syntezie alaniny, glicyny, seryny, z tym że w reakcjach tych czynnikiem redukującym jest NADH.
U Streptococcus sanguis brak jest drugiego układu enzymatycznego, działającego przy niskich stężeniach jonu amonowego, ale wykształcił się mechanizm pozwalający na wykorzystanie jonów amonowych kiedy są w niskich stężeniach - w takiej sytuacji obserwuje się połączenie dwóch aktywności enzymatycznych: dehydrogenazy glutaminianowej i aminotransferazy glutaminian:kwas szczawiooctowy. Powoduje to pozorne zwiększenie powinowactwa dehydrogenazy glutaminianowej do grupy amonowej (bo po pierwsze produkt pierwszego enzymu jest natychmiast usuwany, po drugie substrat jest ciągle odtwarzany, a gdy jest go bardzo dużo to przesuwa równowagę reakcji w kierunku tworzenia produktu).
Gdy środowisko jest zasadowe (a na ogół w organizmach jest lekko zasadowe), mamy do czynienia z solami a nie z kwasami. Na wykresie mamy połączenie biosyntezy łańcucha węglowego z reakcją włączania jonu amonowego do cząsteczki w postaci grupy aminowej. W przypadku nadprodukcji glutaminianu cytrynian musi ulec dalszym przemianom (szkieletem węglowym występującym w cząsteczce glutaminianu jest 2-oksoglutaran). Do przekształcenia 2-oksoglutaranu w glutaminian potrzebne jest NADPH, dostarczane przez szlak pentozowy (aby uzyskać nadprodukcję w komórkach musi być wysoki poziom tego szlaku; szlak ten, poza NADPH, dostarcza też fosfoenolopirogronian, czyli prekursor niezbędny do syntezy 2-oksoglutaranu i szczawiooctanu).
Aby uzyskać nadprodukcję 2-oksoglutaranu z jednej strony musi być dużo szczawiooctanu i dużo acetyloCoA, a z drugiej strony 2-oksoglutaran nie może odpływać do innych przemian. Można zablokować przekształcanie 2-oksoglutaranu do bursztynyloCoA - dehydrogenaza 2-oksoglutaranowa jest hamowana przez wysokie stężenie pirogronianu i szczawiooctanu, a także przez wysoką siłę redukującą (czyli wysoki poziom energetyczny komórki zapewniony przez szlak pentozofosforanowy i dehydrogenazę izocytrynianową). Trzeba też zablokować przekształcanie izocytrynianu do bursztynianu i glioksalanu – obniżenie aktywności (lub jej brak) liazy cytrynianowej i syntetazy jabłczanowej jest wynikiem przejścia z fazy aktywnego wzrostu do stanu stacjonarnego (nadprodukcję najczęściej uzyskujemy w stanach stacjonarnych). Dodatkowo można zmienić (np. w wyniku mutacji) powinowactwo enzymu do substratu ( dehydrogenazy 2-oksoglutaranowej do 2-oksoglutaranu, która ma Km 70 razy większe niż dehydrogenaza glutaminianowa, czyli ma znacznie mniejsze powinowactwo do substratu). Szybkość reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę glutaminianową jest 150 razy większa niż dla dehydrogenazy 2-oksoglutaranowej.
Nadprodukcję można tez spowodować usuwając glutaminian ze środowiska reakcji (na zewnątrz komórki). Można to osiągnąć stosując detergenty lub powodując deficyt biotyny – zmienia się ilość fosfolipidów w błonach oraz zostaje zablokowana biosynteza nienasyconych kwasów (powstają fosfolipidy o zmienionym składzie kwasów tłuszczowych, które są bardziej nasycone, co powoduje że błona staje się bardziej przepuszczalna i praktycznie cały produkt wypływa na zewnątrz komórki).
Glutaminian dodawany jest do przypraw.
Drugim aminokwasem znajdującym dosyć szerokie zastosowanie w gospodarce jest lizyna (często dodawana do pasz). Z jednej strony związana jest z biosyntezą glutaminianu (glutaminian jest dostarczycielem w wyniku reakcji transaminacji grupy aminowej dla asparaginianu); z drugiej strony dla produkcji asparaginianu niezbędny jest wysoki poziom szczawiooctanu dostarczającego szkielet węglowy.
Asparaginian może być wykorzystywany do biosyntezy 4 aminokwasów (2 rozgałęzienia: do lizyny i homoseryny, z homoseryny do metioniny, treoniny czy izoleucyny powstającej w wyniku metabolizmu treoniny). Mechanizmy regulujące te przemiany w mikroorganizmach są bardzo różne, w organizmach wyższych zaś na ogół jest podobnie.
To przykład dwóch mechanizmów: jednego charakterystycznego dla E.coli a drugiego dla bakterii kwasu glutaminowego. W przypadku E.coli pierwszy etap przekształcania kwasu asparaginowego (asparaginianu w jego ufosforylowaną pochodną) może być realizowany przez 3 różne kinazy (izoenzymy) regulowane w odmienny sposób:
1. hamowanie na zasadzie inhibicji zwrotnej przez lizynę + biosynteza enzymu ulega represji w obecności nadmiaru aminokwasu w komórce
2. represja metioniną (synteza hamowana przez metioninę, która powstaje z cysteiny)
3. represja poprzez treoninę i izoleucynę (represja poprzez sumę aminokwasów powstających na tej samej drodze, jeden powstaje z drugiego) + inhibicja zwrotna powodowana przez treoninę (dopiero z treoniny powstaje izoleucyna, nadmiar treoniny powstaje gdy izoleucyna /gdy jest już jej wystarczająco dużo/ hamuje jej przekształcanie; powstaje poziom treoniny hamujący całkowicie biosyntezę)
Dalsze przekształcenie jest hamowane jedynie przez lizynę; zaś przekształcenie semialdehydu asparaginianowego nie jest hamowane w żaden sposób jeśli chodzi o przekształcenie go do lizyny.
W przypadku bakterii kwasu glutaminowego żaden z produktów końcowych szlaku nie hamuje pierwszego przekształcenia; synteza pierwszej kinazy ma charakter konstytutywny (ciągły). Zahamowanie następuje w obecności 2 aminokwasów z różnych szlaków: treoniny i lizyny. Obecność izoleucyny i waliny znosi to hamowanie i dodatkowo podnosi aktywność enzymu. Nie ma żadnej regulacji na poziomie przekształcania semialdehydu w homoserynę; regulacja jest tylko na zasadzie inhibicji zwrotnej przez produkty przekształcania homoseryny. Ten układ biosyntezy jest korzystniejszy (mniej mechanizmów regulacyjnych) dla nadprodukcji lizyny.
Glutaminian nie jest ograniczeniem dla tego procesu (chyba, że jest wytwarzany), bo w wyniku transaminacji odtwarzany jest jego bezpośredni prekursor. Glutaminian może być częściowo zużywany w cyklu Krebsa; też opuszczać komórkę, czemu przeciwdziałamy dodając do podłoża dużo biotyny, co zapewnia syntezę kwasów tłuszczowych i odpowiednią ilość fosfolipidów w błonach – ustala się stały poziom aminokwasów wewnątrz i na zewnątrz komórki i cały glutaminian może iść do reakcji transaminacji. Odtwarzany jest 2-oksoglutaran. Tak więc glutaminian nie stanowi czynnika limitującego, jeśli zapewnione jest jego odtwarzanie.
Proces limituje ilość szczawiooctanu, bezpośredniego prekursora łańcucha węglowego. Można to łatwo obejść – w wyniku karboksylacji fosfoenolopirogronianu. Aby fosfoenolopirogronian nie był wykorzystywany w innych szlakach zbyt intensywnie (a najintensywniej jest wykorzystywany w glikolizie) i aby go było dużo, można otrzymać mutanty auksotroficzne, w których kinaza przekształcająca fosfoenolopirogronian w pirogronian jest nieaktywna. Niewielkie ilości pirogronianu zapewniające odtwarzanie 2-oksoglutaranu i działanie cyklu Krebsa można uzyskać podczas wykorzystania fosfoenolopirogronianu do transportu cukru do wnętrza komórki – w wyniku przeniesienia reszty fosforanowej na cukier jest odtwarzany pirogronian, wykorzystywany dalej w cyklu Krebsa.
Szczawiooctan w wyniku transaminacji jest przekształcany w asparaginian. Regulacja jest na poziomie kinazy asparaginianowej, przekształcającej asparaginian w aspartylo-4-fosforan, przy czym w środowisku muszą być obecne 2 aminokwasy: lizyna i treonina, w odpowiednich stężeniach. Można do nadprodukcji lizyny wykorzystywać mutanty auksotroficzne, które mają zahamowane przekształcenie semialdehydu w homoserynę. Wtedy w środowisku nie pojawiają się te aminokwasy (muszą być dostarczane w minimalnych ilościach, ale nie ma możliwości aby treonina i lizyna razem były w odpowiednich stężeniach aby na zasadzie inhibicji zwrotnej blokować kinazę).
Podobny efekt dają mutanty auksotroficzne metioninowo – treoninowe (mutacje od homoseryny w dół), w których nagromadzenie homoseryny powoduje, że dalsze przekształcanie semialdehydu w homoserynę będzie niemożliwe, a cała ilość semialdehydu będzie kierowana do produkcji lizyny.
Nadprodukcję można też osiągnąć uzyskując mutanty regulatorowe, np. o uszkodzonym miejscu regulatorowym, które nie będzie odpowiadało na obecność lizyny. Mimo pojawienia się treoniny (obie drogi działają) nie nastąpi zahamowanie kinazy. Jeśli dodatkowo sprawimy, że drogi wychodzące od homoseryny będą mniej wydajne, to cały asparaginian będzie przekształcany w lizynę.
Można wykorzystywać mutanty podwójne, z auksotrofią leucynową czy alaninową – powoduje to, że jednostki dwuwęglowe czy trójwęglowe nie są odprowadzane do biosyntezy tych aminokwasów (trójwęglowe do alaniny, dwuwęglowe do leucyny).
*Krótki wywód na temat tego, że biotechnologia jest ok., o ile chodzi np. o uzyskanie nadprodukcji m.in. aminokwasów do pasz. Ale tak, to biotechnologia jest zła – cudowne środki przestają działać (np. antybiotyki na bakterie, zwłaszcza szczepy szpitalne); modyfikowane rośliny, które jeśli się rozsieją i staną roślinami dzikimi, zaczną konkurować z innymi roślinami (a modyfikowane są bardziej przystosowane do środowiska poprzez swoją odporność np. na patogeny), to łatwo je wyprą i będziemy mieli do czynienia z monokulturą (monokultura to wizja trochę przesadzona, ale nie wiemy co się może stać).
Metabolity wtórne to związki nie występujące powszechnie, produkowane często na szlakach zupełnie odmiennych od szlaków, w których powstają metabolity pierwotne. Większość tych związków powstaje na 3 szlakach: na drodze poliketydowej, na szlaku biosyntezy terpenoidów (powstają w nim metabolity pierwotne jak i wtórne, np. cholesterol to metabolit pierwotny, steroidy – metabolity wtórne), metabolizmu aminokwasów.
Szlak poliketydowy przypomina częściowo pierwsze etapy biosyntezy kwasów tłuszczowych. Jest tu również enzym mający 2 miejsca wiążące, zawierający grupy SH, w jednym jest kwas fosfopantoteinowy, na drugim cysteina; odpowiednie acyloCoA (uwaga! na slajdzie błąd) wiążą się z tymi miejscami (przenoszone są na te miejsca reszty acylowe).
W przypadku biosyntezy kwasów tłuszczowych mamy do czynienia z 2 typami cząsteczek: starterem zawsze jest C2 (acetyloCoA), następnie dołączane są jednostki trzywęglowe malonyloCoA. W wyniku dekarboksylacji przy każdym przeniesieniu powstaje parzystowęglowa cząsteczka.
W szlaku poliketydowym cząsteczkami, które mogą być starterami jak i cząsteczkami wykorzystywanymi do wydłużania łańcucha, są wymienione (wymienione są najczęstsze, nie wszystkie).
Procesy biosyntezy, zwłaszcza ketonyloCoA, 2-metylomalonyloCoA, są proste. Prekursorem są albo jednostki trzywęglowe albo czterowęglowe.
Jednostki trójwęglowe przekształcane są w acetyloCoA, z którego po włączeniu do cyklu Krebsa, przez bursztynyloCoA w wyniku izomeryzacji, powstaje 2-metylomalonyloCoA, który może być wykorzystywany jako prekursor w biosyntezie metabolitów wtórnych, albo ulegać dekarboksylacji – powstaje jednostka trójwęglowa propionyloCoA. PropionyloCoA może ulegać karboksylacji i dawać drugi prekursor w biosyntezie metabolitów wtórnych na szlaku poliketydowym 2-metylomalonyloCoA. Karboksylacja i dekarboksylacja nie są przeprowadzane przez ten sam enzym, tylko wymagają dwóch odrębnych enzymów, gdyż są to procesy nieodwracalne(następuje duża zmiana energii; przyłączenie musi odtworzyć energię i wymaga ATP). Procesy karboksylacji i dekarboksylacji mogą być sprzężone z przenoszeniem grupy karboksylowej pomiędzy szczawiooctanem a pirogronianem. Jeśli grupa karboksylowa będzie przenoszona na pirogronian to z 2-metylomalonyloCoA powstaje propionyloCoA; jeżeli odwrotnie to z propionyloCoA na 2-metylomalonyloCoA.
PropionyloCoA może powstawać z izoleucyny, a także gdy do pożywki będzie dodany propanol. 2-metylomalonyloCoA może powstawać z waliny.
Drugim prekursorem na szlaku poliketydowym jest amidomalonyloCoA. Powstaje on w wyniku wprowadzenia grupy amidowej do malonyloCoA (grupa amidowa na malonyloCoA może być przenoszona np. z asparaginy); albo asparaginian (pochodna szczawiooctanu, szczawiooctan też może być przekształcany w wyniku oksydacyjnej dekarboksylacji w kwas malonowy, a następnie po przeniesieniu na CoA dać malonyloCoA) w wyniku metabolizmu jest przekształcany do amidomalonyloCoA. Także acetyloCoA może, w wyniku przeniesienia na karbamoilofosforan, dawać amidomalonyloCoA. Źródłem są też różne procesy związane z karboksylacją acetyloCoA, przeniesienie grupy CoA z acetyloCoA na malonian.
Jeżeli cząsteczka jest dłuższa niż trójwęglowa, to w wyniku kondensacji (podobnej do tej w biosyntezie kwasów tłuszczowych) powstają rozgałęzione cząsteczki.
Schemat jest podobny do biosyntezy kwasów tłuszczowych. Najpierw następuje przeniesienie z odpowiednich acyloCoA reszt acylowych na miejsce donorowe (akceptorowe; p=kwas fosfatydylowy? , c=cysteina); a następnie z miejsca donorowego jest przenoszone na węgiel α. Z równoczesną dekarboksylacją powstaje reszta acetylowa, czterowęglowa, przenoszona jest ona na miejsce donorowe i cykl się powtarza (od 3 do kilkunastu razy, łańcuchy mogą mieć długość dochodzącą do 30-40 atomów węgla, minimalnie 6). Ostatecznie powstaje jednostka poliketydowa. Poliketydy=mające wiele grup ketonowych w cząsteczce.
Dopiero po odłączeniu enzymu mogą zachodzić jakieś modyfikacje tej cząsteczki. Mamy tu przedstawiony szereg związków powstających na drodze poliketydowej – mogą się tworzyć makrocząsteczki będące laktonami, mogą powstawać układy pierścieniowe o różnym stopniu nasycenia (od całkowicie nasyconych do aromatycznych), z grupami od ketonowych do hydroksylowych; mogą być wprowadzone różne podstawniki (chlor, aminocukry, cukry)
Porównując szlak poliketydowy z biosyntezą kwasów tłuszczowych można stwierdzić, że jest to droga, która wymaga znacznie mniej energii, stopień redukcji łańcucha poliketydowego jest znacznie mniejszy niż w przypadku kwasów tłuszczowych (w biosyntezie kwasów tłuszczowych powstają nasycone kwasy tłuszczowe, 16-18C zazwyczaj). W szlaku poliketydowym zmiany mogą prowadzić do powstawania układów pierścieniowych. Poza tym mamy różnego typu prekursory: w przypadku kwasów tłuszczowych mamy tylko acetyloCoA i malonyloCoA; dla poliketydów starterami i jednostkami wydłużającymi może być znacznie więcej cząsteczek. Produkty szlaku poliketydowego mogą dodatkowo ulegać modyfikacjom, np. metylacji, hydroksylacji. W związku z tym ilość takich związków poliketydowych jako metabolitów wtórnych może być nieograniczona.
(!opisując drogę poliketydową nie piszemy że jest podobna do biosyntezy kwasów tłuszczowych. Można na końcu wspomnieć.)
Przedstawiona tu została biosynteza antybiotyków na przykładzie antybiotyku β-laktamowego. Penicylina jest antybiotykiem składającym się z 3 aminokwasów, jeden z nich jest aminokwasem niebiałkowym, zaś walina ma odmienną konfigurację od tej normalnie spotykanej w białkach (tu mamy D, a w białkach wszystkie aminokwasy są L).
Biosynteza penicyliny odbywa się tak jak biosynteza glutationu: następuje aktywacja przez przeniesienie reszty fosforanowej z ATP na grupę karboksylową aminokwasu (powstaje wiązanie wysokoenergetyczne), a taki uaktywniony aminokwas jest przenoszony na grupę aminową i powstaje wiązanie peptydowe. Powstaje dipeptyd, który po aktywacji może być przeniesiony na trzeci aminokwas. Takie mechanizmy są dosyć powszechne jeśli chodzi o biosyntezę antybiotyków peptydowych o krótszych łańcuchach. Gdy łańcuch polipeptydowy jest długi, to syntetyzowany jest on na takiej drodze jak białko, z tym, że później podlega różnym modyfikacjom posttranslacyjnym, które powodują, że w takiej cząsteczce trudno się dopatrzeć aminokwasu.
Po kondensacji aminokwasów zachodzi cyklizacja cząsteczki i powstaje układ β-laktamowy. Pierścień β-laktamowy zawiera wiązanie laktamowe, czyli wewnątrzcząsteczkowe wiązanie między grupą karboksylową a grupą aminową.
Trzecim szlakiem, na którym powstają metabolity wtórne, jest biosynteza jednostek pięciowęglowych (pirofosforanu izopentenylu i pirofosforanu dimetyloallilu), których wydłużanie głowa-ogon powoduje powstawanie cząsteczek bardzo długich, takich jak np. kauczuku. Wydłużanie przez połączenie głowa-głowa daje jednostki 10, 20, 30,40 węglowe.
Dawniej sądzono, że wszystkie terpenoidy powstają na szlaku mewalonianowym: z 3 cząsteczek acetyloCoA w wyniku kondensacji powstaje 3-hydroksy-3-metyloglutaryloCoA, który następnie w wyniku działania reduktazy 3-hydroksy-3-metyloglutaryloCoA jest przekształcany w mewalonian, a ten w wyniku fosforylacji a później dekarboksylacji jest przekształcany w pirofosforan izopenrenylu, który może być w wyniku izomeryzacji przekształcany w pirofosforan dimetyloallilu. W przypadku bakterii, grzybów, zwierząt to są wszystkie terpenoidy syntetyzowane w tych organizmach; w przypadku roślin to tylko seskwi (15C) i triterpeny(30C). Synteza ta odbywa się na terenie cytoplazmy poza plastydami.
W przypadku cyjanobakterii i plastydów stwierdzono obecność innej drogi – szlaku Rohmera: jednostka trzywęglowa i aktywny aldehyd octowy kondensują ze sobą i w wyniku kolejnych przekształceń powstaje pirofosforan izopentenylu, co daje w ostateczności możliwość biosyntezy terpenoidów takich jak mono(10C), di(20C) i tetraterpeny(40C). synteza odbywa się w plastydach.
Jeśli chcemy u jakiegoś organizmu uzyskać biosyntezę terpenoidów, to najpierw musimy się zastanowić do jakiej grupy dany organizm należy i jakie mu trzeba podać prekursory.
15
morcys1