1. Strategie genoterapii
W zależności od typu choroby stosowane są różne strategie terapii genowej:
a. Komplementacja defektu genetycznego.
Do komórek z defektem genetycznym wprowadzana jest prawidłowa kopia genu, na podstawie której powstanie białko, którego wcześniejszy brak lub nieprawidłowe funkcjonowanie powodowało objawy choroby. Strategia stosowana jest w przypadku chorób monogenowych recesywnych np. mukowiscydozy, anemii sierpowatej, hemofilii.
b. Korekta mutacji.
Metoda polega na naprawie defektu genetycznego (uszkodzony fragment genu lub cały gen zastępowany jest poprawną sekwencją). Najczęściej do tego celu wykorzystuje się oligonukleotydy lub rybozymy (RNA o aktywności katalitycznej). Strategia jest wykorzystywana w próbach leczenia chorób monogenowych recesywnych i dominujących (np. pląsawicy Huntingtona).
c. Zahamowanie ekspresji zmutowanego genu.
Jako preparat podaje się antysensowne oligonukleotydy, rybozymy lub siRNA (mały interferujący RNA) wiążące docelową sekwencję DNA lub RNA i degradujące ją. Strategia ma na celu inaktywację genów, których produkty odpowiedzialne są za powstanie choroby. Metoda znalazła zastosowanie w przypadku chorób infekcyjnych, nowotworowych oraz chorób monogenowych dominujących.
d. Eliminacja komórek.
Do komórek docelowych wprowadzane są preparaty genowe zawierające cDNA kodujące białka wywołujące śmierć nieprawidłowych komórek np. czynniki proapoptotyczne, immunostymulujące, toksyczne białka lub ich prekursory. Metoda jest stosowana w przypadku chorób infekcyjnych i nowotworowych
e. Nadanie komórkom nowych cech fenotypowych.
Przykładem jest terapia proangiogenna polegająca na podaniu preparatów genowych zawierających cDNA kodujące proangiogenne czynniki indukujące formowanie nowych naczyń krwionośnych. Terapia proangiogenna znalazła zastosowanie w leczeniu chorób układu krążenia np. niedokrwienia serca i kończyn. Innymi przykładami tego typu strategii są szczepionki DNA mające na celu immunizację ustroju oraz terapia antyangiogenna wykorzystywana w próbach leczenia nowotworów.
Główne problemy terapii genowej
Stosunkowo proste założenia terapii genowej okazały się trudne w realizacji. Pojawiło się wiele problemów uniemożliwiających osiągnięcie efektu terapeutycznego i zastosowanie terapii genowej w klinice. Dlatego też prowadzone są dalsze badania mające na celu ominięcie zaistniałych barier. Przede wszystkim należy zapewnić bezpieczeństwo procedury poprzez przygotowanie nietoksycznych, nieimmunogennych preparatów genowych zgodnych z wymogami farmakopealnymi. Należy także zaprojektować sposób podania (łatwy, bezpieczny i efektywny) oraz określić dawkę preparatu. Ponadto preparaty genowe powinny być łatwe i tanie w syntezie i przechowywaniu. Poważnym problemem jest także brak wydajnego systemu transferu genów do jąder komórkowych komórek docelowych. Z tym z kolei są związane problemy z uzyskaniem długotrwałej ekspresji transgenu na odpowiednim poziomie. Przyczyną niestabilnej ekspresji są także trudności z uzyskaniem ukierunkowanej integracji wprowadzanego DNA, przez co konieczne staje się wielokrotne podawanie preparatu genowego, co z kolei przyczynia się do powstania odpowiedzi immunologicznej ze strony organizmu. Wydajna ekspresja na stałym poziomie wymaga także dobrania odpowiedniego systemu ekspresyjnego tzn. odpowiedniego konstruktu wektora, przy czym szczególną uwagę należy zwrócić na wybór promotora inicjującego transkrypcję.
2. Nukleotydy antysensowne
Są komplementarne i do promotora i do genu – przyłączanie do promotora jest wydajniejsze.
Antysensowne oligonukleotydy liczą 20-30 nukleotydów (zarówno rybo-, jak i deoksyrybonukleotydy), których sekwencja jest komplementarna do mRNA (czyli antysensowna) lub też sekwencji DNA genu lub jego promotora. Oligonukleotydowe antysensy hybrydyzują z mRNA tworząc przestrzenną „przeszkodę”, uniemożliwiając przyłączenie mRNA do rybosomów. Hamowanie ekspresji genu za pomocą antysensu polega także na powstaniu dwupasmowego „hybrydu” złożonego z mRNA i antysensownego oligonukleotydu, który aktywuje enzym RnazęH, której działanie polega na degradacji mRNA w tym dupleksie. Antysensowne oligonukleotydy mogą także wiązać się z sekwencjami DNA, tworząc przestrzenne struktury tripleksów. Gdy struktura taka powstanie w obrębie promotora uniemożliwia wiązanie czynników transkrypcyjnych i hamuje tym samym transkrypcję.
Antysens
Technika wykorzystywana w terapii nowotworów. Oparta jest na hamowaniu syntezy określonych białek poprzez antysensowne oligonukleotydy. Antysensowne oligonukleotydy to 12-30 nukleotydowe fragmenty DNA. Hamowanie syntezy niechcianych białek może przebiegać w dwojaki sposób:
- poprzez asocjację antysensu do wybranej sekwencji pre-RNA, zaburzając składanie
- przez asocjację antysensu do dojrzałego mRNA blokując dostęp do rybosomu, bądź tworząc heterodupleks degradowany przez RNAzę.
3. Rybozymy - co to jest i jakie to ma zastosowanie w genoterapii
Substancje zbudowane z kwasu rybonukleinowego (RNA) zdolne do katalizowania pewnych reakcji chemicznych. Spełniają zatem funkcje analogiczne do enzymów białkowych.
Rybozymy występują u wszystkich organizmów, przede wszystkim w mechanizmie syntezy białek oraz przemian kwasów nukleinowych. Transferaza peptydylowa - enzym wchodzący w skład rybosomów, który tworzy wiązania peptydowe, jest rybozymem (rRNA). Inną ważną funkcją rybozymów snRNA jest wycinanie intronów ze świeżo zsyntetyzowanego mRNA. Niektóre rybonukleazy także są rybozymami.
Rybozymy spełniają też wiele innych funkcji, m.in. wchodzą w skład wielu wirusów.
Pojawiły się już pierwsze eksperymentalne wykorzystania rybozymów do leczenia chorób, m.in. zakażenia HIV, oraz do terapii genowej.
Właściwości katalityczne rybozymów:
- możliwość tworzenia skomplikowanej struktury II i III rzędowej przez parowanie krótkich odcinków w obrębie cząsteczki
- tworzenie niestandardowych par zasad
- obecność grupy –OH przy węglu 2’ rybozy
- możliwość koordynacji kationów metali dwuwartościowych
Właściwości i pochodzenie rybozymów:
- występują w wirusach i katalizują specyficzną reakcję cięcia RNA uczestnicząc w namnażaniu się wirusa (Hammerhead, Hairpin, VS, HDV)
- występują w połączeniu z białkami, jako nukleoproteiny (RNAza P)
Zastosowanie rybozymów:
- wyciszanie genów przez specyficzne cięcie RNA
- terapia antyretrowirusowa
- leczenie chorób związanych z ekspansją trójek nukleotydowych i anomalnymi długościami transkryptu (choroba Huntingtona, dystrofia mięśniowa)
- co się stanie jeżeli wprowadzimy do organizmu nadmiar oligonukleotydów DNA - mogą reagować z innymi składnikami kom, np enzymami i zaburzać ich aktywność, mogą też stymulować wydzielanie cytokin
5. siRNA (small interfering RNA) – dwuniciowe cząsteczki RNA o długości ok. 20-25 par zasad, które powodują wyciszanie ekspresji genów o homologicznej sekwencji (interferencja RNA - RNAi). Powstają przez pocięcie dwuniciowego RNA (np. wirusowego) w komórce przez enzym Dicer na fragmenty odpowiedniej długości. Krótkie siRNA wiążą sie z kompleksem białkowym o aktywności rybonukleazy zwanym RISC. Kompleks ten wiąże się z komplementarną do siRNA cząsteczką mRNA i tnie ją na kawałki, uniemożliwiając w ten sposób powstanie kodowanego przez nią białka. Zazwyczaj - w przeciwieństwie do miRNA - sekwencja siRNA jest w 100% homologiczna z sekwencją docelowego mRNA. Rośliny (i inne organizmy eukariotyczne) wykorzystują mechanizm interferencji RNA powodowany przez siRNA do obrony przed wirusami. Ponadto sztuczne siRNA wykorzystywane są w biologii molekularnej, prowadzone są też badania nad zastosowaniem ich w medycynie.
6. W jaki sposób można dokonać korekcji zmutowanego genu, jak to działa i który sposób jest najwydajniejszy?
- za pomocą chimerycznych oligodT (70-80 nukleotydów),
- jednoniciowych fragmentów DNA (400-800 nukleotydów; najwydajniejsze, sprawność korekcyjna 1-10%, podczas gdy oligodT - 0.0002%)
- za pomocą rybozymów
7. Sposoby bezpośredniego i pośredniego niszczenia kom nowotworowych
W przypadku chorób, w których powstaniu i przebiegu bierze udział wiele różnych genów (np. chorób nowotworowych) manipulacje takie, prowadzące do korekty zmienionego patologicznego fenotypu na fenotyp prawidłowy, są trudne do przeprowadzenia. W chorobach nowotworowych wykorzystuje się raczej zabiegi polegające na wprowadzeniu do komórek nowotworowych genów, których białkowe produkty mają doprowadzić do zniszczenia komórek nowotworowych [2, 3].
W badaniach przedklinicznych oraz we wstępnych próbach klinicznych stosuje się dwa typy (rodzaje) niszczenia komórek nowotworowych: niszczenie bezpośrednie oraz tzw. niszczenie pośrednie (Ryc. 1., który przedstawia podstawowe założenia terapii genowej chorób nowotworowych).
Niszczenie bezpośrednie komórek nowotworowych polega na tym, że wprowadzony do nich gen (najczęściej pochodzenia wirusowego lub bakteryjnego) koduje enzym metabolizujący nieaktywny prolek do aktywnego leku [4]. Jest to tzw. koncepcja genów samobójczych: wprowadzone geny „uczulają” komórki nowotworowe na pewnego typu leki lub „radiouczulają” je na promieniowanie jonizujące; zob. m.in. nasze prace [5, 6].
Niszczenie pośrednie polega na tym, że wprowadzony do komórek nowotworowych gen koduje białko, tzw. białko immunomodulacyjne (najczęściej: różnego typu cytokiny), mobilizujące układ immunologiczny do swoistego niszczenia komórek nowotworowych [2, 3, 7].
W ostatnich latach pojawiła się nowa strategia dotycząca pośredniego niszczenia komórek nowotworowych, tzw. antyangiogenna terapia genowa [8]. W terapii tej wykorzystuje się geny, których ekspresja prowadzi do zahamowania angiogenezy. Przypomnijmy, że zahamowanie angiogenezy w nowotworach (ograniczenie powstawania naczyń w guzach pierwotnych i przerzutach) prowadzi do zahamowania ich wzrostu. Angiogenezie oraz białkowym inhibitorom angiogenezy poświęciliśmy odrębne artykuły [9, 10].
Metody tworzenia genetycznie zmodyfikowanych organizmów
Aby otrzymany organizm był transgeniczny, należy do niego wprowadzić kawałek DNA, który pochodzi od obcego organizmu. Nim jakiś organizm zostanie genetycznie zmieniony, transformowany, należy posiadać fragment materiału genetycznego, który pochodzi z innego organizmu. Może on zostać wycięty z większego fragmentu DNA, dzięki enzymom restrykcyjnym. Są to cząsteczki białek, które potrafią przecinać nić DNA, częstokroć czynią to w specyficznym miejscu, dzięki czemu możliwe jest wycięcie takiego fragmentu, jaki jest potrzebny.
Tak przygotowany materiał jest wprowadzany do zwierząt bądź roślin. Ten fragment najczęściej zwiera informację (koduje) cząsteczki białka, które będą wykorzystane przez organizm. Samo wprowadzenie materiału genetycznego nie jest łatwe. Metody, którymi biotechnologowie się posługują by tego dokonać bywają odmienne w odniesieniu do roślin i zwierząt, dlatego omówione zostaną osobno.
Przedstawione poniżej metody dotyczą modyfikacji roślin.
1. Metoda z wykorzystaniem wektora.
W tej metodzie, jak sama nazwa wskazuje, wykorzystuje się wektory do wprowadzenia materiału genetycznego do komórek roślinnych. Są nimi bakterie z rodzaju Rhizobium: Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes, które posiadają naturalną zdolność do wprowadzania swojego DNA do roślin. Te mikroorganizmy posiadają w swojej komórce plazmid, który zawiera zakodowaną informację o białkach niezbędnych do zaatakowania rośliny. To właśnie on wnika do komórki roślinnej, a jeden z jego fragmentów, nazwany odcinkiem T (T-DNA), integruje się z materiałem genetycznym komórki gospodarza. Naukowcy potrafią usunąć geny znajdujące się wewnątrz fragmentu T, a na ich miejsce wstawić dowolny inny fragment DNA, który może zawierać geny pochodzące z innego gatunku. Obecnie do transformacji roślin używa się plazmidów pochodzących z Agrobacterium tumefaciens.
Metoda ta ma poważne ograniczenie - można ja stosować wyłącznie do roślin dwuliściennych, ponieważ tylko one ulegają zarażeniu przez Agrobacterium. Rośliny jednoliścienne, do których należą zboża, nie mogą być transformowane tym sposobem.
2. Metody bez wykorzystania wektora.
Są to metody polegające na bezpośrednim wprowadzeniu DNA do komórek roślinnych. Pozwalają one na transformowanie dowolnych roślin. Nim fragment będzie mógł być wprowadzony do komórki gospodarza, ta musi być pozbawiona ściany komórkowej (oprócz mikrowstrzelowania). By to osiągnąć można poddać ją działaniu enzymów degradujących.
Otrzymuje się w ten sposób tzw. protoplast, którego błona komórkowa stanowi koleją barierę dla transgenu, wprowadzanego do komórek z wykorzystaniem jednej z metod, ogólnie podzielonych na fizyczne i chemiczne.
- Elektroporacja, fizyczna - polega na wykorzystaniu serii impulsów elektrycznych, które naruszają strukturę błony, powodując powstanie w niej porów, przez które DNA może przeniknąć do wnętrza komórki. Podejście to może być stosowane też przy wprowadzaniu genów do innych komórek - zwierzęcych, bakteryjnych.
- Mikrowstrzeliwanie, fizyczna - wykorzystuje mikroskopijne kulki z złota lub wolframu o średnicy 0,5 - 5 mikrometra (0,0000005-0,000005 metra). Fragmenty DNA które pragnie się wprowadzić do komórek są opłaszczane na tych kulkach, a następnie wstrzeliwane do komórek roślinnych. Używana jest do tego tzw. "armatka genowa" (ang. particle gun). Wadą metody jest niska wydajność oraz mogące wystąpić uszkodzenia komórek. Zaletą jest to iż komórki nie muszą być pozbawiane ściany komórkowej, można wprowadzać do np. do fragmentu liścia, jak i DNA może zostać wprowadzona także do chloroplastów i mitochondriów.
- Z użyciem PEG, chemiczna - polega na wykorzystaniu glikolu polietylenowego (PEG od ang. polyethylene glycol), który powoduje zwiększenie przepuszczalności błony komórkowej, poprzez prowadzenie do jej chwilowej, odwracalnej dezorganizacji. To pozwala na wniknięcie transgenu do komórek, wraz z DNA nośnikowym.
- Fuzja liposomów - tworzone są liposomy, wewnątrz których są cząsteczki DNA. Tworzy się je poprzez utworzenie podwójnej błony lipidowej na roztworze z cząsteczkami DNA i wstrząsanie nie - powstają wtedy "kuleczki" błonowe z DNA w środku. Liposomy łączą się z protoplastami komórek wprowadzając do środka DNA.
- Mikroiniekcja - polega na wprowadzeniu DNA za pomocą igły mikromanipulatora, doświadczenie wykonywanie jest przez ręcznie człowieka. Metoda praco- i czasochłonna.
Komórki macierzyste o cechach komórek embrionalnych
Polskim naukowcom pracującym na Uniwersytecie Louisville w Kentucky (USA) i współpracującym z kilkoma ośrodkami w Polsce, po raz pierwszy na świecie udało się wyizolować ze szpiku kostnego dorosłej myszy ...
magzielony