Drożdże killerowe i ich potencjalne wykorzystanie
dr inż. Paweł Satora, prof. dr hab. inż. Tadeusz Tuszyński
Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej
Akademia Rolnicza w Krakowie
Począwszy od odkrycia systemu killerowego u drożdży ponad 40 lat temu, intensywne badania znacząco zwiększyły naszą wiedzę w wielu dziedzinach biologii i dostarczyły szczegółowych danych dotyczących podstawowych aspektów biologii komórki eukariotycznej, jak również interakcji wirus-komórka gospodarza i ogólnie wirusologii drożdży. Analiza struktury toksyny killerowej, ich syntezy i sekrecji umożliwiła zrozumienie podstawowych mechanizmów komórkowych, takich jak posttranslacyjne przekształcanie prepro-protein w cyklu wydalniczym. Ponadto badanie receptorowego charakteru działania toksyn okazało się być efektywnym sposobem analizowania struktury molekularnej drożdżowych i grzybowych ścian komórkowych, dostarczając ważnych szczegółów związanych ze zwalczaniem infekcji wywoływanych przez ludzkie patogeny drożdżowe. Poza ich ogólnym znaczeniem w zrozumieniu biologii komórki eukariotycznej, drożdże, toksyny i wirusy killerowe, są również niezwykle interesujące ze względu na możliwość ich wykorzystania w biomedycynie i technologii genowej.
Charakterystyka drożdży killerowych
Drożdże killerowe są mikroorganizmami wydzielającymi białkowe lub glikoproteinowe toksyny, które zabijają wrażliwe komórki tego samego lub pokrewnego gatunku. Optymalna temperatura biosyntezy większości białek killerowych mieści się w przedziale 20-24°C, a optymalnym pH dla ich aktywności jest przedział 4,2-5,0. Synteza toksyn związana jest z obecnością wewnątrzkomórkowych cząsteczek różnych grup wirusów.
W zależności od zdolności do syntezy toksyn i wrażliwości na nie, szczepy drożdży dzielimy na trzy grupy: killerowe (KS), neutralne (N) i wrażliwe (S), co przedstawia tabela 1.
Zjawisko killerowe zaobserwowano po raz pierwszy u drożdży z gatunku Saccharomyces cerevisiae w 1963 roku. Do chwili obecnej cecha killerowa stwierdzona została również u przedstawicieli licznych innych rodzajów drożdży tj. Debaryomyces, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Cryptococcus, Ustilago, Rhodotorula, Williopsis, Torulopsis, Zygosaccharomyces, Hansenula, Hanseniaspora i Metschnikowia. W zależności od charakterystyki tworzonej toksyny, szczepy zaliczono do trzydziestu różnych grup oznaczonych literą „K” i kolejną liczbą.
Drożdże S. cerevisiae zaklasyfikowano do trzech głównych grup killerowych (K1, K2, K28) na podstawie mechanizmu syntezy, przekształceń wewnątrzkomórkowych, sekrecji i lokalizacji receptorów w komórkach wrażliwych, na które działają.
Wymienione wyżej mikroorganizmy tworzą toksyny killerowe wykazujące różnice w ich genetycznym uwarunkowaniu, spektrum aktywności letalnej w stosunku do szczepów wrażliwych, mechanizmie wytwarzania oraz wielkości cząsteczek (tab. 2).
Białka syntetyzowane przez szczepy killerowe charakteryzują się wysoko specyficznym spektrum działania uzależnionym od wartości pH, temperatury i warunków natlenienia środowiska. Poszczególne toksyny różnią się miedzy sobą odpornością na działanie enzymów proteolitycznych, wrażliwością na substancje chemiczne (np. cykloheksimid, oranż akrydyny), optymalnym pH działania, stabilnością temperaturową oraz są względem siebie antagonistyczne.
Fenotyp killerowy jest bardzo częstym zjawiskiem wśród drożdży. Wykazywany jest zarówno u kultur izolowanych ze środowiska naturalnego (owoce, grzyby, fermentacja spontaniczna, gleba, rozkładający się materiał roślinny), jak i u mikroorganizmów pochodzących z kolekcji czystych kultur.
Geny, odpowiedzialne za produkcję toksyn i równocześnie nadające szczepom odporność na nią, mogą być zlokalizowane w cytoplazmatycznie dziedziczonym dwuniciowym RNA (dsRNA), na liniowym, dwuniciowym DNA (dsDNA), bądź też na chromosomie (tab. 2).
Aktywność killerowa jest jednym z istotniejszych mechanizmów współzawodnictwa między szczepami, a w warunkach naturalnych, odgrywa bardzo ważną rolę w ekologii drożdży, szczególnie przy małej dostępności składników pokarmowych w otoczeniu.
Tworzenie toksyn killerowych i ich oddziaływanie na komórki wrażliwe
W najlepiej zbadanym systemie killerowym, u Saccharomyces cerevisiae, produkcja toksyn killerowych K1, K2, K28 i odporność na nie jest związana z obecnością cytoplazmatycznie dziedziczonego, satelitarnego M-dsRNA (odpowiednio M1, M2, M28 dla poszczególnych toksyn). Molekuły M-dsRNA zamknięte są w cząstkach wirusów obecnych w dużej liczbie kopii w komórce i zawierają informacje niezbędne do syntezy białka killerowego. Funkcjonowanie i replikacja tych genomów w cytoplazmie zainfekowanych komórek jest ściśle uzależniona od koegzystencji z grupą drożdżowych wirusów pomocniczych L-A.
Wirusy L-A należą do rodziny Totiviridae, mają genom zamknięty w ikosaedralnej otoczce białkowej i powielają się w komórkach gospodarza niezależnie od obecności satelitarnego M-ds RNA. Dojrzała cząsteczka wirusa L-A zawiera pojedynczą molekułę dsRNA o wielkości 4,6 kb, składającą się z pozytywnej nici RNA (L-A(+)ssRNA), która jest materiałem gentycznym dla cząstek potomnych oraz stanowi matrycę do wytwarzania białek strukturalnych i enzymów replikowanych wirusów. Na nici ssRNA znajduje się również ramka odczytu Gag-Pol, która wymagana jest do inicjacji całego cyklu replikacyjnego, zarówno wirusa L-A, jak i wirusa satelitarnego M (rys. 1).
Rys. 1. Cykl replikacyjny wirusów: pomocniczego L-A i satelitarnego M (Schmitt, Breinig, 2002)
Obydwa dsRNA wirusów współzawodniczą, w procesie enkapsydacji, replikacji in vivo (np. syntezie negatywnej nici RNA) oraz tworzeniu (+)ssRNA na podwójnej matrycy RNA.
W przeciwieństwie do wirusów L-A, każdy z trzech genomów M-dsRNA (M1, M2 i/lub M28) zawiera pojedynczą ramkę odczytu, kodującą prekursor właściwej toksyny killerowej tzw. preprotoksynę (pptox).
K1 i K28 są najlepiej zbadanymi toksynami killerowymi kodowanymi przez wirusy. Pomimo znacznych różnic w składzie aminokwasowym oraz mechanizmie oddziaływania na wrażliwe komórki drożdży, wykazują jednak podobieństwa w syntezie, wydzielaniu i przetwarzaniu. Każda toksyna powstaje w postaci preprotoksyny (pptox) składającej się z trzech podjednostek: α, β i γ oraz dwóch fragmentów odłączanych podczas aktywacji toksyny: pre i pro (rys. 2).
Rys 2. Struktura preprotoksyny K28 (Schmitt, Breinig, 2002)
Prekursor preprotoksyny zawiera N-końcową sekwencję sygnałową, która umożliwia jej transport do retikulum endoplazmatycznego, gdzie następuje glikolizacja segmentu γ, który jest prawdopodobnie wyznacznikiem odporności. W wyniku działania enzymu - peptydazy sygnałowej (SP), następuje rozszczepienie łańcucha aminokwasowego preprotoksyny, prowadząc do powstania protoksyny zawierającej N-glikolizowaną sekwencję γ, która oddziela od siebie podjednostkę α (10,5 kDa) i β (11 kDa) (rys. 2). Dalej w aparacie Golgiego, protoksyna jest rozszczepiana przez endopeptydazy, które powodują usunięcie wewnątrzczasteczkowej sekwencji γ, co w konsekwencji prowadzi do wydzielania dojrzałych heterodimerycznych toksyn białkowych zbudowanych z podjednostek α i β połączonych mostkami dwusiarczkowymi (w przypadku toksyny K1 - 2 mostki, K2 i K28 - 1 mostek).
Wrażliwość szczepów drożdży na toksyny killerowe uzależniona jest od licznych czynników tj. rodzaju stosowanej toksyny, szczepu drożdży, stadium wzrostu oraz stanu fizjologicznego kultury.
Oddziaływanie drożdży killerowych na wrażliwe komórki obejmuje dwa etapy. Pierwszy etap nie wymaga nakładu energii i obejmuje szybkie wiązanie heterodimerycznego białka killerowego z receptorami ściany komórkowej wrażliwych komórek. W przypadku K1 i K2 główny receptor stanowi b-1,6-D-glucan lub mannan, natomiast dla toksyny K28 jest to a-1,3-mannoproteina o wysokiej masie cząsteczkowej, obecna w ścianie komórkowej.
Rys. 3. Droga wydzielania toksyn killerowych (K1, K2, K28) u Saccharomyces cerevisiae (Schmitt, Breinig, 2002)
Drugi energochłonny etap obejmuje translokację toksyny K1 lub K2 do membrany cytoplazmatycznej i interakcję z receptorem drugiego rzędu (rys. 4). Następstwem związania się toksyny ze ścianą komórkową jest szereg fizjologicznych zmian, których końcowym efektem jest śmierć wrażliwej komórki. Początkowo ma miejsce załamanie gradientu protonowego i aminokwasowego, następuje wyciek jonów potasu, w kolejnym stadium dochodzi do uwolnienia ATP, zmniejszenia poziomu metabolitów oraz zniszczenia gradientu pH membrany komórkowej. Wszystkie wymienione procesy stopniowo prowadzą do śmierci wrażliwych komórek drożdży.
Rys.4. Mechanizm oddziaływania toksyn killerowej K1 na wrażliwe komórki drożdży (Schmitt, Breinig, 2002)
R1- receptor pierwszego rzędu, R2- receptor drugiego rzędu, N- jądro komórkowe
W przeciwieństwie do toksyny K1, która działa na powierzchni komórek, toksyna K28 wnika do cytoplazmy drogą endocytozy (rys. 5). Po związaniu z receptorem trafia poprzez struktury Golgiego i retikulum endoplazmatyczne do cytozolu, skąd wysyła sygnał do jądra komórkowego drożdży powodując zahamowanie syntezy DNA i cyklu komórkowego.
Rys.5 Schemat oddziaływania toksyny K28 na komórkę drożdży (Schmitt, Breinig, 2002) R1- receptor pierwszego rzędu, R2- receptor drugiego rzędu, N- jądro komórkowe
Mutacje w obrębie wirusa M-dsRNA zmieniają standardowy fenotyp killerowy i mogą dotyczyć zarówno jakości, jak i ilości wydzielanej toksyny, odporności oraz replikacji M-dsRNA. Mutanty neutralne są wadliwe w tej części genomu, która jest odpowiedzialna za kodowanie prekursora toksyny w związku z tym wydzielają nieaktywne białko killerowe ze względu na zmienioną sekwencję nukleotydów w kodującym je M-dsRNA. Mutanty zwane „samobójcami” produkują toksynę w normalnej ilości, lecz wykazują obniżoną odporność na nią ze względu na uszkodzony region M-dsRNA determinujący tę cechę.
Efekt toksyny killerowej jest zależny od składu podłoża hodowlanego, a także od fazy wzrostu mikroorganizmu. Badania wykazały, że kultura wolno rosnąca lub głodująca jest mniej podatna na szkodliwe substancje od szczepu rosnącego wykładniczo i na medium z odpowiednio dobranym stężeniem cukru.
Komórki drożdzy wrażliwych, można ochronić przed letalnym działaniem toksyny. W trakcie pierwszego stadium, tj. wiązania białka killerowego z receptorami znajdującymi się w ścianie komórkowej, ochrona ta polega na inkubacji w podłożu minimalnym, dodaniu jonów wapnia do pożywki, bądź podniesieniu wartości pH i/lub temperatury hodowli. Jeśli jednak toksyna przejdzie do drugiego nieodwracalnego etapu działania, tj. nastąpią reakcje z membranami cytoplazmatycznymi komórki wrażliwej, powyższe czynniki nie są już skuteczne. Przejście do stanu nieodwracalnego można utrudnić poprzez dodatek do podłoża ADP, natomiast produkcję białka killerowego hamuje również wysokie stężenie cukru.
Wykorzystanie drożdży i toksyn killerowych
Podczas ostatnich dwóch dekad, toksyny killerowe, jak i szczepy drożdży je produkujące znalazły liczne zastosowania.
Wkrótce po zaobserwowaniu, że toksyny killerowe mogą być czynnikiem powodującym zahamowanie i/lub przedłużanie fermentacji wina, w wyniku antagonistycznego oddziaływania na wrażliwe szczepy drożdży winnych, podjęto liczne próby wykorzystania naturalnych lub „skonstruowanych” szczepów killerowych, jako kultury starterowe w fermentacji piwa i wina. Wykorzystanie technologii rekombinowanego DNA, umożliwiło zaprojektowanie licznych kultur killerowych, które charakteryzowały się bardzo szerokim zakresem aktywności killerowej i były w stanie zwalczać potencjalne zakażenia drożdżowe, powodowane przez szczepy Candida, Hanseniaspora, Kloeckera i Pichia.
Ostatnio zaobserwowano, że Kluyveromyces phaffii produkuje toksynę killerową (KpKt), która aktywnie działa na zakażenia drożdży winnych. KpKt wykazuje szerokie działanie przeciwko drożdżom Hanseniaspora / Kloeckera podczas fermentacji win, dlatego też, istnieje potencjalna możliwość zastosowania jej jako czynnika konserwującego w przemyśle winiarskim. Obecnie, zahamowanie rozwoju zakażeń drożdżami dzikimi dokonuje się poprzez dodatek SO2 do świeżego moszczu. Ten czynnik antyseptyczny, który może działać w większych stężeniach toksycznie na organizm ludzki, jest również dodawany do nastawów w końcu fermentacji, w celu polepszenia właściwości przeciwutleniających. Użycie KpKt jako substytutu SO2 podczas etapu wstępnej fermentacji, ograniczyłoby dodatek w okresie odfermentowywania, a przez to również zmniejszyłoby ilość tego związku w produkcie finalnym. Co więcej, KpKt wykazuje również aktywność przeciwko drożdżom należącym do gatunków Saccharomyces ludwigii, Zygosaccharomyces bailii oraz Z. rouxii, dzięki czemu obiecująco przedstawia się zastosowanie tej toksyny do kontroli zakażeń drożdżowych w słodzonych napojach alkoholowych i bezalkoholowych.
Przeciwgrzybowe białka, peptydy i ich syntetyczne pochodne znajdują, potencjalne zastosowanie w leczeniu grzybic ludzkich, których ilość dramatycznie wzrosła w ostatnim dwudziestoleciu, głównie z uwagi na dużą ilość pacjentów z osłabioną barierą immunologiczną. Białka przeciwgrzybiczne są naturalnie wytwarzane przez różne grupy mikroorganizmów m.in. bakterie, grzyby, owady, bezkręgowce, kręgowce, jak również rośliny. W poszukiwaniu nowych i bardziej selektywnych czynników przeciwgrzybowych, najatrakcyjniejsze wydają się związki działające na ściany komórkowe grzybów i drożdży, ponieważ struktury te nie występują w komórkach ssaków. Ściany komórkowe drożdży w przeważającej mierze zawierają w warstwie zewnętrznej mannoproteiny, a dodatkowy szkielet glukanowy składa się z liniowych i rozgałęzionych L-1,3- i L-1,6-D-glukanów, w mniejszym stopniu z chityny. Ponieważ każdy z wymienionych związków może stać się pierwszorzędowym miejscem wiązania dla różnych toksyn killerowych, badania skupiają się obecnie nad możliwości wykorzystania toksyn killerowych, jako nowych substancji przeciwgrzybowych. Wśród tej grupy związków, toksyny killerowe wydzielane głównie przez drożdże nie należące do rodzaju Saccharomyces, wykazują szerokie spektrum działania zwalczając dużą liczbę patogenów ludzkich i roślinnych. Na szczególną uwagę zasługują toksyny tworzone przez przedstawicieli rodzaju Hansenula, które nie tylko przyłączają się do komponentów drożdżowej ściany komórkowej, ale również inhibują biosyntezę nowych łańcuchów L-1,3-D-glukanu. Środki przeciwgrzybowe oparte na tego typu działaniu, mogą być porównywane do antybiotyków, które hamują biosyntezę ścian komórkowych bakterii. Wadą omawianych substancji jest fakt, że ich cytotoksyczna działalność ograniczona jest wąskim zakresem pH oraz temperaturą 20-30 0C, stąd też, raczej nie mogą być stosowane doustnie i/lub dożylnie, jednak wykorzystanie powierzchniowe na zainfekowaną skórę wydaje się możliwe.
Próby skonstruowania roślin uprawnych wykazujących odporność na patogeny, zaowocowały powstaniem kultur transgenicznych, które są zdolne do syntezy substancji, tj. polipeptydy, wykazujących działanie toksyczne na pasożyty. Pod tym względem, toksyny killerowe naturalnie wytwarzane i wydzielane przez grzybowy patogen Ustilago maydis stanowią źródło materiału genetycznego, który może uodporniać m.in. rośliny tytoniu, na choroby grzybowe. Mikroorganizm ten znany, jako głownia kukurydzy, pasożytuje na kukurydzy i wywołuje workowate narośla, wypełnione czarną, proszkowatą masą zarodników. Niektóre szczepy drożdży U. maydis, są naturalnie zainfekowane dsRNA wirusem, który zawiera informację genetyczną na temat sekrecji przeciwgrzybowych toksyn białkowych. Z trzech różnych toksyn killerowych produkowanych przez U. maydis (KP1, KP4 i KP6), heterodimeryczna toksyna białkowa KP6 oraz monomeryczna KP4, zostały pomyślnie przeniesione do komórek tytoniu, przy użyciu konstytutywnego promotora wirusa mozaiki kalafiora. W obu przypadkach, zademonstrowano, że uzyskane rośliny transgeniczne są zdolne do przekształcania toksyny killerowej w jej postać aktywną i dojrzałą, nie różniącą się od syntezowanej przez komórki Ustilago. Poziom ekspresji toksyny KP6 jest jednak jak dotychczas zbyt niski, aby mógł być skutecznie użyty do kontroli patogenów grzybowych. Przeciwnie, u rekombinanta z toksyną KP4 mały fragment liścia tytoniu wydzielał wystarczającą ilość do skutecznego zabicia komórek grzybów fitopatogennych wrażliwych na toksynę KP4. Omówione dane wykazują, że systemiczna produkcja kodowanych przez wirusy toksyn drożdżowych w roślinach uprawnych może dostarczyć nowych narzędzi do biologicznego zwalczania patogenów grzybowych.
Drożdże piekarskie (S. cerevisiae), jak również drożdże rozszczepkowe (Schizosaccharomyces pombe) są nie tylko bardzo dobrym systemem do studiowania biologii komórki eukariotycznej oraz kontroli cyklu komórkowego, ale stanowią również znakomite, szybko rosnące źródło białek. Tradycyjnie, ekspresja i oczyszczanie białek heterologicznych są związane z wykorzystywaniem komórek prokariotycznych, głównie E. coli i Bacillus subtilis. Jednakże, kiedy wymagana jest ekspresja białek eukariotycznych, systemy bakteryjne często okazują się nieskuteczne, ponieważ ograniczone są ich post-translacyjne modyfikacje, tj. N-glikozylacja, fosforylacja i acetylowanie białek. Dlatego też, za potencjalnych producentów białek heterologicznych zaczyna się coraz częściej uważać jednokomórkowe eukarionty, tj. drożdże S. cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, K. lactis oraz S. pombe. W przeciwieństwie do większości „białek obcych”, które tworzone są i pozostają w cytozolu komórkowym, istnieje tylko kilka wydzielanych na zewnątrz komórki. Białka sekrecyjne zawierają hydrofobową, N-terminalną sekwencje sygnałową, która umożliwia im przedostanie się do cyklu wydzielniczego komórki, obejmującego m.in. transport do retikulum endoplazmatycznego i późniejsze sotowanie w aparatach Golgiego. Podczas ostatniego dziesięciolecia, wzrosła liczba ciekawych z medycznego i/lub farmaceutycznego punktu widzenia białek sekrecyjnych (tj. mysia K-amylaza, ludzka antytrombina III lub fosfataza alkaliczna z łożyska), które zostały uzyskane jako pozakomórkowe białka przy użyciu sygnałów sekrecji pochodzących z drożdżowej inwertazy, kwaśnej fosfatazy lub plazmidowej toksyny killerowej K. lactis. Wykazano, że sygnał sekrecji i przetwarzania pochodzący z wirusa killerowego ScV-M28 S. cerevisiae jest w pełni funkcjonalny u drożdży rozszczepkowych (S. pombe) i może być wykorzystany do wydzielania „białek obcych”, do pozakomórkowego medium. Ponadto, sekrecja białka heterologicznego prowadzona przez sygnał preprototoksyny K28, jest wysoko wydajnym systemem podczas tworzenia zielonego fluorescencyjnego białka (GFP), czyniąc z drożdży rozszczepkowych atrakcyjnego gospodarza dla przetwarzania i wydzielania białek obcych. Powyższe przykłady sugerują, że wektory oparte na preprototoksynie mogą być bardzo atrakcyjne dla procesu syntezy i uzyskiwania dużych ilości białek heterologicznych u drożdży.
Przez lata, dużo nauczono się na temat biologii komórki eukariotycznej poprzez analizę killerowych szczepów S. cerevisiae i kodowanych przez wirusy wewnątrzkomórkowe toksyn białkowych. Wirusowy system killerowy u drożdży okazał się nie tylko modelowym do badań komórek eukariotycznych, ale również do analizowania bardziej specyficznych aspektów wirusów drożdżowych oraz interakcji wirus-komórka gospodarza. Poza tym, drożdże produkujące toksyny killerowe znalazły zastosowanie w przemyśle spożywczym i fermentacyjnym, gdzie okazały się być selektywnym narzędziem do zwalczania zakażeń drożdżowych podczas fermentacji winiarskiej, piwowarskiej i piekarskiej. Toksyny wydzielane przez omawiane mikroorganizmy zostały wykorzystane do konserwowania żywności, wykrywania medycznie ważnych szczepów patogennych, sporządzania środków przeciwgrzybicznych, a także w technologii rekombinowanego DNA. Wszystko to stało się możliwe, dzięki szczegółowej analizie kilku szczepów toksynotwórczych, które wytypowano spośród ponad 700 znanych obecnie kultur killerowych. W tym względzie, nadal większość szczepów drożdży killerowych nie została przebadana, istnieje również wiele mikroorganizmów dotychczas nie odkrytych, które mogą wykazywać potencjalne korzyści dla przemysłu spożywczego, medycyny i innych gałęzi nauki.
LITERATURA
1. Comitini F., Di Pietro N., Zacchi L., Mannazzu I., Ciani M. 2004. Kluyveromyces phaffii killer toxin active against wine spoilage yeasts: purification and characterization. Microbiology, 150, 2535-2541.
2. Gulbiniene G., Kondratiene L., Jonkantaite T., Serviene E., Melvydas V., Petkuniene G. 2004. Occurence of killer yeast strains in fruit and berry wine yeast populations. Food Technol. Biotechnol., 42 (3), 159-163.
3. Magliani W., Conti S., Gerloni M., Bertolotti D., Polonelli L. 1997. Yeasts killer system. Clin. Microbiol. Rev., 10, 369-400.
4. Marquina D., Santos A., Peinado J.M. 2002. Biology of killer yeasts. Int. Microbiol., 5, 65-71.
5. Schmitt M., Breinig F. 2002. The viral killer system in yeast: from molecular biology to application. FEMS Microbiol. Rev., 26, 257-276.
6. Selitrennikoff C.P. 2001. Antifungal proteins. Appl. Environ. Microbiol., 67 (7), 2883-2894.
7. Yap N.A., de Barros Lopes M., Langridge P., Henschke P.A. 2000. The incidence of killer activity of non-Saccharomyces yeasts towards indigenous yeast species of grape must: potential application in wine fermentation. J. Appl. Microbiol., 89, 381-389.
...
Ataraksja