ĆW 1 Obecność wiązania peptydowego w białku lub peptydzie. zawierającym. co najmniej dwa takie wiązania, można wykryć za pomocą reakcji biuretowej Piotrowskiego, która polega na zdolności tworzenia przez jony miedziowe w środowisku zasadowym fioletowego kompleksu z tym wiązaniem. Najprostszym związkiem dającym tę reakcję jest biuret, od którego pochodzi nazwa reakcji. Właściwości chemiczne aminokwas6w i białek, a także niektóre fizykochemiczne są wykorzystywane w różnych reakcjach w celu identyfikacji lub rozdziału tych związków. Obecność w roztworze wolnych aminokwasów można wykryć za pomocą reakcji ninhydrynowej, w której bierze udział zarówno grupa 2-karboksylowa, jak i 2-aminowa. W obecności wolnego aminokwasu i ninhydryny po podgrzaniu powstaje niebiesko fioletowy produkt kondensacji (prolina, hydroksyprolina, cysteina i cystyna dają produkt o zabarwieniu żółtym). Obecność aminokwasów zawierających grupę aromatyczną zarówno wolnych, jak i wchodzących w skład peptydów i białek wykrywa się za pomocą reakcji ksantoproteinowej, która polega na powstaniu pod wpływem kwasu azotowego nitrowych pochodnych pierścieni aromatycznych, mających w środowisku zasadowym zabarwienie pomarańczowe. Aminokwasy zawierające w swym składzie grupy hydrosulfidowe (-SH) można wykryć traktując ich roztwory wodorotlenkiem sodowym, co w podwyższonych temperaturach powoduje wydzielanie się gazowego siarkowodoru o ostrym, charakterystycznym zapachu; z solami ołowiawymi wytwarzają one czarny nierozpuszczalny siarczek ołowiawy.
Cw2 Metoda Lowry’ego i współpracowników. W metodzie tej wykorzystuje się dwie cechy budowy białek: obecność wiązań peptydowych oraz obecność dwóch aminokwasów aromatycznych - tyrozyny i tryptofanu oraz jednego siarkowego - cysteiny. Reakcja biuretowa (tworzenie kompleksów przez wiązania peptydowe i jony miedziowe) jest wzmocniona w tej metodzie inną reakcją z odczynnikiem Folina i Ciocalteu, w której kwas fosforomolibdenowy i fosforowolframowy ulega redukcji do błękitu fosforomolibdenowego z udziałem tyrozyny, tryptofanu i cysteiny. Stężenie barwnego (fioletowego) kompleksu można mierzyć kolorymetrycznie w zakresie widma widzialnego długości 600-700 nm. Podobnie jak w innych metodach kolorymetrycznych stężenie białka odczytuje się z krzywej wzorcowej. Przy tym dla uzyskania właściwych wyników niezmiernie ważny jest dobór białka wzorcowego do sporządzania tej krzywej. Powinno ono zawierać w cząsteczce ilość tyrozyny, tryptofanu i cysteiny możliwie zbliżoną do badanego białka.Zaletą metody jest znaczna jej czułość, można bowiem oznaczyć ilość białka już od 1 mg w próbie, a zależność proporcjonalną między intensywnością zabarwienia roztworu a stężeniem białka obserwuje się nawet przy większych stężeniach - do 200 mg. Wadą metody jest błąd oznaczenia wynikający z trudności doboru odpowiedniego białka wzorcowego w stosunku do białka oznaczanego. Inną wadą jest zawyżanie wyników oznaczania w wyciągach nie dializowanych z powodu redukcji odczynnika Folina przez wolne aminokwasy i niewielkie peptydy. Poza tym metoda jest mało przydatna w bezpośrednim oznaczaniu zawartości białka w preparatyce enzymatycznej, w której stosowane są związki ochronne, np. EDTA (kwas dwuwersenowy) ditiotreitol, cysteina itd., a które mogą również redukować odczynnik Folina.
ĆW3 Wpływ temperatury w miarę wzrostu temperatury reakcja enzymatyczna, podobnie jak każda reakcja chemiczna, początkowo ulega przyspieszeniu w związku z dostarczaniem energii cieplnej do układu. Podwyższenie temperatury przyspiesza szybkość reakcji zgodnie z regułą van't Hoffa, która głosi, że podwyższenie temperatury o 10°C powoduje około dwukrotny wzrost szybkości reakcji enzymatycznych. W określonej temperaturze zostaje osiągnięte optimum działania enzymu, a przy dalszym jej wzroście następuje gwałtowny spadek, co jest związane z denaturacją cieplną białka enzymu. Optymalna temperatura działania większości enzymów, tzn. najwyższa temperatura, przy której nie ujawnia się jeszcze wpływ denaturujący, waha się w granicach 30-50°C. Zakres temperatury optymalnej może się jednak zmieniać w zależności od czasu trwania reakcji, zmian stężenia jonów wodorowych oraz różnego stopnia zanieczyszczenia innymi białkami. Zazwyczaj obecność substratu i optymalne dla danego enzymu pH zmniejszają jego podatność na denaturację cieplną. Obecność substratu sprzyja bowiem utrzymaniu właściwej konformacji cząsteczki białka enzymu. Takie optymalne stężenie jonów wodorowych , wpływając na stan zdysocjowania reszt aminokwasowych enzymu zapewnia zachowanie jego struktury przestrzennej. Odpowiednie stężenie jonów wodorowych jest ważnym czynnikiem warunkującym aktywność enzymu. Krzywe przedstawiające zależność aktywności enzymatycznej od pH nie zawsze mają typowy kształt dzwonu. Najodpowiedniejsze stężenie jonów wodorowych, tzn. takie, przy którym szybkość działania enzymu jest największa, nazywamy optimum pH. Dla większości enzymów znajduje się ono w zakresie 5-7. Wpływ pH na aktywność danego enzymu zależy od wartości stałej dysocjacji: a) grup jonizujących w centrum aktywnym enzymu uczestniczących w wiązaniu substratu, b) grup funkcyjnych w cząsteczce substratu, którymi wiąże się on z enzymem, c) grup funkcyjnych w cząsteczce enzymu, od których zależy kataliza, d) innych grup w cząsteczce enzymu, których stan zjonizowania może warunkować jego katalitycznie aktywną konformację.Optimum pH może ulegać pewnym zmianom zależnie od stopnia czystości preparatu enzymu i temperatury środowiska. Wartość pH wewnątrz komórki może stanowić ważny czynnik w regulacji metabolizmu.
WYZNACZANIE STAŁEJ Km DLA FOSFATAZY KWAŚNEJ I OZNACZENIE AKTYWNOŚCI TEGO ENZYMU
Fosfatazy (fosfomonoesterazy) należą do enzymów klasy hydrolaz, podklasy esteraz i katalizują hydrolizę różnych estrów fosforanowych. Zależnie od typu substratu wyróżnia się szereg typów fosfataz. Najbardziej rozpowszechnione są wśród nich hydrolazy monoestrów fosforanowych, katalizujące reakcje hydrolizy zgodnie ze schematem:
Naturalnymi substratami dla hydrolaz monoestrów fosforanowych są: estry fosforanowe cukrów (glukozo-6-fosforan, fruktozo-l,6- bisfosforan), fosfoseryna i inne. Fosfatazy wykazują niską specyficzność substratową i w związku z tym zależnie od optimum pH dla ich działania klasyfikowane są na: fosfatazy kwaśne o optimum pH ok. 5 i fosfatazy-alkaliczne o optimum pH ok. 9. Fosfataza kwaśna występuje w dużych stężeniach w nasionach roślin i gruczole krokowym człowieka. Aktywność jej bardzo silnie wzrasta w chorobie nowotworowej tego gruczołu, co wykorzystuje się w diagnostyce do wczesnego rozpoznawania tej postaci raka. W nasionach roślin aktywność fosfatazy kwaśnej silnie wzrasta podczas kiełkowania, a następnie maleje w miarę wzrostu siewek. Prawdopodobnie wzrost jej aktywności związany jest z uwalnianiem fosforanu nieorganicznego z organicznych form zapasowych fosforanu, np. z mezoinozytoloheksafosforanu (kwasu fitynowego). Aktywność fosfataz oznacza się zazwyczaj używając sztucznych substratów, takich jak: 2-glicerofosforan, fenylofosforan, fosforan fenoloftaleiny, 4-nitrofenylofosforan. Aktywność enzymu mierzy się ilością uwolnionego fosforanu lub części organicznej estru po inkubacji enzymu z substratem w ściśle określonych warunkach. Szczególnie dogodny jako substrat jest 4-nitrofenylofosforan, gdyż jeden z produktów reakcji przechodzi w formę barwną już po zalkalizowaniu środowiska. W ćwiczeniu będzie wykorzystany wodny wyciąg enzymu z kiełków pszenicy. Jako substrat będzie użyty 4-nitrofenylofosforan. Powstający produkt reakcji - 4-nitrofenol - przyjmuje w środowisku zasadowym barwę żółtozieloną i jest miarą aktywności fosfatazy.
ĆW. V - OZNACZENIE AKTYWNOŚCI PROTEOLITYCZNEJ TRYPSYNY Trypsyna. Enzym ten, nalezący do endopeptydaz, podpodklasy proteinaz serynowych, jest jednym z ważniejszych enzymów trawiennych. Jest wydzielany przez trzustkę w formie nieaktywnego zymogenu- trypsynogenu. Proenzym w jelicie cienkim przekształcany jest w formę enzymatycznie aktywną. Trypsynogen składa się z pojedynczego łańcucha polipeptydowego zawierającego 249 reszt aminokwasowych o znanej sekwencji. Przekształca się on w formę aktywną z udziałem innej proteinazy- enteropeptydazy wytworzonej przez śluzówkę jelita cienkiego lub pod działaniem aktywnych cząsteczek trypsyny (autokataliza). Aktywacja trypsynogenu polega na rozerwaniu wiązania peptydowego i odłączeniu niewielkiego peptydu (6-12 reszt aminokwasowych, zależnie od pochodzenia), który blokuje centrum aktywne enzymu, nie dopuszczając do kontaktu z substratem. Trypsyna stanowi pojedynczy łańcuch polipeptydowy. W centrum aktywnym wystepują 2 reszty seryny i histydyna jako aminokwasy kontaktowe. Katalizuje hydrolizę wiązań peptydowych, w których grupy karbonylowe należą do argininy lub lizyny. Jej masa cząsteczkowa wynosi 23000 Da, a optimum pH zawiera się w granicach 7-9. efektem działani trypsyny na białko są peptydy o różnej długości łańcucha. Zasada metody. Szybkośc reakcji enzymatycznej katalizowanej przez trypsynę zależy od rodzaju zastosowanego substratu i metody jaj oznaczania. Na cwiczeniu aktywnośc trypsyny będzie oznaczona metodą Ansona, która polega na pomiarze ilości tyrozyny zawartej w peptydach uwolnionych w trakcie w trakcie hydrolizy, które nie wytrącają się 3-proc. kwasem trichlorooctowym. Roztwór białka (substratu) inkubuje się z enzymem w pH 8,6 i temp 37°C. Oznaczenie zawartości tyrozyny wykonuje się fotometrycznie przy użyciu odczynnika Folina . Końcowa barwa, której natężenie jest wprost proporcjonalne do ilości tyrozyny w próbie , jest wynikiem redukcji odczynnika Folina w środowisku zasadowym do błękitu fosforomolibdenowego przez zawartą w peptydach tyrozynę. Miara aktywności otzrymanego na cwiczeniu preparatu trypsyny będzie liczba m moli tyrozyny zawarta w uwolnionych peptydach.
ĆW. IV - OZNACZENIE AKTYWNOŚCI ENZYMÓW (b-amylaza) Oznaczenie aktywności b-amylazy słodowej metodą Bernfelda Zasada metody. W metodzie Bernfelda wykorzystuje się właściwości redukujące maltozy i innych cukrów, które w środowisku zasadowym redukują grupy nitrowe kwasu 3,5-dinitrosalicylowego (DNS) do grup aminowych. Powstałe pochodne aminowe mają barwę pomarańczową, której intensywność zależy od ilości w próbie cukrów redukujących (głównie b-maltozy) uwalnianych podczas działania enzymu, dlatego reakcja ta może stanowić podstawę do ich oznaczenia fotometrycznego. (substratem jest roztwór skrobii)
ĆwVI-BADANIE SKŁADNIKÓW KWASÓW NUKLEINOWYCHZarówno w DNA jak i w RNA najczęściej występującymi zasadami są pochodne purynowe- adenina i guanina, oraz pochodna pirymidynowa- cytozyna. Poza tym w RNA wystepuje pochodna pirymidynowa- uracyl, a w DNA pochodna pirymidynowa- tymina.Wyróżnia się dwa sposoby: PIERWSZY wymaga hydrolizy tych związków do składników podstawowych, a nastepnie ich rozdział oraz identyfikację. Hydrolizę przeprowadza się chemicznie lub enzymatycznie. Chemicznie najczęściej wykonuje się hydrolizę, traktując frakcje kwasów nukleinowych zasadami lub kwasami, np. 0,3-molowym wodorotlenkiem sodowym w temp.37°C, 6-molowym kwasem solnym w temp.100°C lub 12-molowym kwasem nadchlorowym w temp.100°C. oba rodzaje kwasów nukleinowych zachowują się różnie pod wpływem tych związków. DNA jest na ogół trwalszy i jego hydroliza przebiega dopiero z udziałem mocnych kwasów, podczas gdy RNA ulega hydrolizie już przy słabych zasadach. Związane jest to z brakiem w deoksyrybozie grupy hydroksylowej w pozycji 2’. Całkowitą hydrolizę można też przeprowadzić stosując specyficzne enzymy- nukleazy oraz nukleotydazy i nukleozydazy. Rozdziału składników po hydrolizie dokonuje się stosując metodę chromatografii podziałowej, jonowymiennej lub metodę elektroforezy.
ĆwVI-BADANIE SKŁADNIKÓW KWASÓW NUKLEINOWYCH Najczęściej stosowaną metodą rozdziału jest chromatografia podziałowa bibułowa, w której po rozwinięciu chromatogramu w końcowej fazie przeprowadza się reakcje barwne na pentozy i porównuje wartości Rf cukru badanego i standardowego. Przy wykrywaniu zasad azotowych identyfikację umożliwia zjawisko fluorescencji lub absorpcji światła nadfioletowego długości fali 260-280 nm przez układy sprzężone wiązań podwójnych w pochodnych puryn i pirymidyn. Związki te wygaszają fluorescencję bibuły i w miejscach ich położenia pojawiają się ciemne plamy, które można porównać z wartościami Rf zasad standardowych.DRUGI sposób badania składników kwasów nukleinowych związany jest z wywoływaniem reakcji barwnych w preparatach nie hydrolizowanych lub po hydrolizie bez stosowania rozdziału składników podstawowych. Nie hydrolizowane kwasy nukleinowe (RNA i DNA) wykazują reakcję wspólną na obecność pentozy, tzw reakcję Biala. Natomiast reakcją odróżniającą oba typy kwasów w formie nie hydrolizowanej jest reakcja Dischego na obecność b-D-2-deoksyrybozy. Z innych reakcji barwnych, charakterystycznych jednaj tylko dla preparatów hydrolizowanych , należy wymienić reakcję na obecność fosforanów oraz na obecność tyminy. Reakcja na obecność fosforanów jest wspólna zarówno dla DNA, jak i RNA. Polega na łączeniu się molibdenianu amonowego z jonem fosforanowym, tworzy się wówczas kompleks soli amonowej heteropolikwasu tetratrimolibdenianofosforowego o barwie żółtej. Reakcja na obecność tyminy, odróżniająca oba typy kwasów, polega na wytworzeniu przez tę zasadę z diazową pochodną kwasu sulfanilowego kompleksu o barwie czerwonobrunatnej; dodatek hydroksyloaminy w środowisku zasadowym wzmacnia barwę kompleksu.( Hydroliza kwasu deoksyrybonukleinowego niezbędna do przeprowadzenia reakcji na obecność tyminy i kwasu ortofosforowego).
VII-REAKCJE CHARAKTERYSTYCZNE SACHARYDÓW Właściwością sacharydów bardzo często wykorzystywaną w oznaczeniach jest ich zdolność do redukowania innych związków. Właściwośc ta związana jest z występowaniem łańcuchowej cząsteczki sacharydów w formie zawierającej reaktywną grupę aldehydową lub ketonową. Wszystkie monosaharydy mają więc właściwości redukujące. Właściwości redukujących nie mają te disaharydy których wiązanie glikozydowe utworzone jest z udziałem obydwu węgli acetalowych ponieważ w takiej cząsteczce nie może nastąpic w roztworze otwarcie pierścienia piranozowego lub furanozowego z odtworzeniem grup: aldehydowej bądź ketonowej. W reakcji Benedicta w środowisku zasadowym (sprzyjającym przesuniąciu równowagi między forma pierścieniową i łańcuchową sacharydu w kierunku reaktywnej formy łańcuchowej) następuje utlenienie sacharydów redukujących do odpowiednich hydroksykwasów a obecne w odczynniku Benedicta jony Cu2+ redukują się do jonów Cu+ wypadających z roztworu w postaci nierozpuszczalnego tlenku miedziawego(Cu2O). W reakcji Barfoeda redukcja jonów miedziowych przeprowadzana jest w środowisku słabo kwaśnym co powoduje znaczne obniżenie reaktywności sacharydów. W przewidzianych doświadczeniem warunkach reakcji(pH, czas trwania) tylko w roztworze monosacharydu pojawi się czerwony osad tlenku miedziawego. Pod wpływem wyższych stężeń jonów wodorowych oraz wysokiej temperatury disacharydy ulegają łatwo hydrolizie. Oznaczane właściwości redukcyjne roztworu po hydrolizie wynikają więc z obecności w nim produktów hydrolizy – monosacharydów. Kwasy mineralne w wyższych stężeniach powodują również odwodnienie cząsteczek sacharydów z utworzeniem odpowiednich w stosunku do ich budowy furfurali (aldehydowe pochodne furanu). Produkty odwodnienia kondensując z fenolami dają połączenia o różnych zabarwieniach. Właściwości te wykotzystano w reakcjach Molisch, Biala, i Seliwanowa. W reakcji Molischa wszystkie sacharydy po odwodnieniu kwasem siarkowym dają z alfa-naftolem fioletowo zabarwiony produkt kondensacji. W reakcji Biala tylko pentozy przekształcają się w furfural kondensujący z orcynolem w wyniku czego powstaje produkt o barwie zielonej. Odczynnik Seliwanowa zawiera natomiast rezorcynol który z produktem odwodnienia ketoz – hydroksymetylofurfuralem daje barwę łososiową.
VII-REAKCJE CHARAKTERYSTYCZNE SACHARYDÓW Wykonanie 1. Reakcja Molischa. Jest ona charakterystyczna dla wszystkich sacharydów. Odmierzyć do dwóch probówek po 1 mI dowolnych roztworów sacharydów. Do obydwu probówek dodać po 2 lub 3 krople a-naftolu, wymieszać i następnie po ściance pochylonej probówki wprowadzić powoli 3 ml stężonego kwasu siarkowego ) tak, aby spłynął on na dno probówki. Nie mieszać 2. Reakcja Benedicta charakterystyczna dla sacharydów redukujqcych. Odmierzyć do trzech probówek po 1 ml: do pierwszej –glukozy, do drugiej – maltozy i do trzeciej – sacharozy. Do każdej probówki dodać 2,5 mI odczynnika Benedicta i ogrzewać przez kilka minut we wrzącej łaźni wodnej. Do czwartej probówki odmierzyć 1 ml sacharozy, dodać 2 lub 3 krople stężonego kwasu solnego, wymieszać i ciągle mieszając ogrzewać przez minutę nad płomieniem palnika. Ostudzić zawartość probówki, dodać 2,5 mI odczynnika Benedicta i wstawić na kilka minut do wrzącej łaźni wodnej. 3,Reakcja Barfoeda charakterystyczna dla monosacharydów redukujqcych. Odmierzyć do jednej probówki 1 ml glukozy, a do drugiej 1 ml maltozy. Dodać po 2,5 mI odczynnika Barfoeda, wymieszać i ogrzewać przez 3 min we wrzącej łaźni wodnej. 4. Reakcja Seliwanowa charakterystyczna dla ketoz. Odmierzyć do jednej probówki 1 mI fruktozy, do drugiej 1 ml glukozy, dodać 3 ml odczynnika Seliwanowa i ogrzewać przez 1 minutę we wrzącej łaźni wodnej. 5. Reakcja Biala charakterystyczna dla pentoz. Do dwóch probówek odmierzyć po 5 ml odczynnika Biala i ogrzewać przez 5 minut we wrzącej łaźni wodnej. Następnie do jednej probówki dodać 1 ml arabinozy, a do drugiej 1 ml glukozy, wymieszać i ogrzewać przez kolejne 5 minut.
ALA-TYR-CYS
Zaky80