Przemysław Kraska gr. III

Badanie składników kwasów nukleinowych.

Wykonanie:

Do cylindra o objętości 100ml zawierającego 20ml wodnego roztworu kwasów nukleinowych wlać 40ml alkoholu etylowego. Wytrącony w tych warunkach osad kwasów nukleinowych nawinąć na bagietkę. Nadmiar alkoholu usunąć, przyciskając bagietkę z nawiniętą „szpulką” osadu do ścianki cylindra.

Otrzymany preparat kwasów nukleinowych rozpuścić w 3ml 0,1-molowego wodorotlenku sodowego. Z tego roztworu do jednej probówki odmierzyć 2ml w celu przeprowadzenia hydrolizy kwasów nukleinowych, a do pozostałego w probówce 1ml roztworu dodać 8ml 0,1-molowego wodorotlenku sodowego w celu przygotowania roztworu do przeprowadzenia reakcji Biala i reakcji Dischego.

Reakcja Biala- na wykrywanie pentoz. Do dwu probówek odmierzyć po 5ml odczynnika Biala i wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 5 minut.. Do jednej probówki dodać 1ml rozcieńczonego roztworu kwasów nukleinowych, a do drugiej 1ml 0,1-molowego wodorotlenku sodowego (próba kontrolna) i ogrzać przez 15 minut we wrzącej łaźni wodnej.

Reakcja Dischego- na wykrywanie deoksyrybozy. Do jednej probówki odmierzyć 1ml rozcieńczonego roztworu kwasów nukleinowych, a do drugiej 1ml 0,1-molowego woorotlenku sodowego (próba kontrolna). Do obu probówek wlać po 2ml roztworu difenyloaminy i wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 5 minut.

Hydroliza kwasu deoksyrybonukleinowego. Do probówki zawierającej 2ml roztworu kwasu nukleinowego w 0,1-molowym wodorotlenku sodowym dodać 2ml kwasu nadchlorowego. Wykonać równoległą próbę kontrolną, dodając do drugiej probówki 2ml 0,1-molowego wodorotlenku sodowego i 2ml kwasu nadchlorowego. Hydrolizę prowadzić we wrzącej łaźni w ciągu 1 godziny.

Po zakończonej hydrolizie odmierzyć do jednej probówki 2ml hydrolizatu, a do drugiej probówki 2ml roztworu próby kontrolnej. Zobojętnić obie próby, dodając 1,5ml 5-molowego wodorotlenku sodowego. Roztworów tych używać do wykonania reakcji na obecność tyminy.

Pozostałe nie zobojętnione 2ml hydrolizatu i 2ml próby kontrolnej rozcieńczyć dodając do każdej z nich po 4ml wody i stosować do wykrywania kwasu ortofosforowego.

Reakcja na wykrywanie tyminy. Do dwu probówek odmierzyć po 2,5ml roztworu węglanu sodowego i po 1ml odczynnika diazowego. Do jednej z tych probówek dodać 0,5ml zobojętnionego hydrolizatu kwasów nukleinowych, a do drugiej 0,5ml zobojętnionego roztworu próby kontrolnej. Po 5 minutach do obu probówek dodać po 1ml 3-molowego wodorotlenku sodowego i 2,3 krople hydroksyloaminy. Po 5 minutach obserwować intensywność zabarwienia roztworu.

Reakcja na wykrywanie kwasu fosforowego. Do jednej probówki odmierzyć 1ml kwaśnego hydrolizatu kwasów nukleinowych, a do drugiej 1ml próby kontrolnej. Dodać do obydwu probówek po 2ml roztworu molibdenianu amonowego.

Wyniki:

Po hydrolizie w probówkach uzyskano następujące barwy:

-probówka z roztworem kontrolnym– bezbarwna

-probówka z roztworem kwasów nukleinowych- barwa ciemnożółta

Po reakcji Dischego uzyskano następujące barwy:

-probówka z roztworem kontrolnym- bezbarwna

-probówka z roztworem kwasów nukleinowych- barwa ciemnoniebieska

Po reakcji Biala uzyskano następujące barwy:

-probówka z roztworem kontrolnym- barwa żółta

-probówka z roztworem kwasów nukleinowych- barwa zielona

Po reakcji na wykrywanie tyminy:

-nie otrzymano odpowiednich barw, reakcja wykonana nieprawidłowo

Po reakcji na wykrywanie kwasu fosforowego:

-nie otrzymano odpowiednich barw, reakcja wykonana nieprawidłowo

Wnioski:

Nie hydrolizowane kwasy nukleinowe (RNA i DNA) wykazują reakcję wspólną na obecność pentozy, tzw. rekcję Biala.

Reakcją odróżniającą oba typy kwasów w formie nie hydrolizowanej jest reakcja Dischego na obecność b-D-2-deoksyrybozy.

Reakcja na obecność fosforanów jest tylko dla preparatów hydrolizowanych. Polega na łączeniu się molibdenianu amonowego z jonem fosforanowym, tworzy się wówczas kompleks soli amonowej heteropolikwasu tetratrimolibdenianofosforowego o barwie żółtej. Reakcja ta jest wspólna dla DNA i RNA.

Reakcja na obecność tyminy także jest stosowana dla preparatów hydrolizowanych. Odróżnia oba typy kwasów, polega na wytworzeniu przez tę zasadę z diazową pochodną kwasu sulfanilowego kompleksu o barwie czerwonobrunatnej.

2