Sondy molekularne i hybrydyzacja

Sonda molekularna

Definicja: Posiadający znacznik (fluorochrom, ligand, izotop radioaktywny) odcinek DNA, który może zidentyfikować (swoiście wykryć) określoną sekwencję.

Rodzaje sond

Znakowanie sond molekularnych

1.    Nick-translation:

a)    wprowadzanie nacięć

·          wykorzystywana DNAza I

·          liczba nacięć przypadkowa, zależna od stosunku stężeń enzymu i DNA

·          potrzebne jony Mg2+

b)   wprowadzenie znakowanych nukleotydów

·          nukleotydy z izotopem fosforu w pozycji α (najczęściej tylko jeden znakowany)

·          wykorzystanie holoenzymu polimerazy DNA I z E. coli

·          aktywność 5' -> 3' egzonukleazowa odłącza pojedyncze nukleotydy

·          aktywność 5' -> 3' polimerazowa wbudowuje znakowane dNTP

2.    Metoda heksamerowa:

a)    denaturacja DNA

b)   wiązanie heksanukleotydów o przypadkowej sekwencji

c)    wydłużanie starterów przez podjednostkę Klenowa polimerazy DNA I

d)   znakowany jeden spośród dNTP (izotop fosforu w pozycji  α)

e)    potrzebne jony Mg2+

3.    Wypełnianie lepkich końców:

a)    hydroliza DNA nukleazą restrykcyjną

b)   podjednostka Klenowa polimerazy DNA I wypełnia koniec 3'

c)    znakowany jeden spośród dNTP (izotop fosforu w pozycji  α)

d)   potrzebne jony Mg2+

4.    Znakowanie końca 5':

a)    kinaza polinukleotydowa

b)   wykorzystywana do znakowania sond oligonukleotydowych

c)    znacznik w pozycji γ!

Znakowanie RNA

·          transkrypcja

·          konieczny promotor

·          polimeraza RNA specyficzna dla danego promotora

·          substraty: U, C, G, A (jeden z nich znakowany)

·          wyznakowany RNA jest bardzo nietrwały

Specyficzność sond

Długie – stabilne – nawet 20% niezgodności nie przeszkadza w stabilności wiązania, kosztem jednak niskiej specyficzności.

Krótkie – niestabilne :-] – nawet jeden niekomplementarny nukleotyd uniemożliwia stabilne wiązanie – bardzo wysoka specyficzność.

Hybrydyzacja

Ogólny schemat

              DNA              sonda DNA

                      denaturacja alkaliczna              denaturacja             

              ssDNA              sonda ssDNA

                            mieszanie i ponowne łączenie        

              renaturacja                            renaturacja

              wyjściowy DNA               heterodupleks                  odtworzona sonda

                            sonda-DNA    

Hybrydyzacja z sondami

1.    Transfer Southerna`a

a)    przebieg:

·          Elektroforeza

·          Denaturacja alkaliczna

·          Przeniesienie DNA na filtr nitrocelulozowy

·          Wysycenie pozostałych miejsc wiążących DNA na filtrze zdegradowanym DNA

·          Hybrydyzacja DNA z sondą na filtrze

·          Usunięcie nadmiaru sondy

·          Nałożenie kliszy fotograficznej

·          Wywołanie kliszy

b)   zastosowanie:

·          badania genomowego DNA

·          fingerprinting

·          RFLP

·          sondy oligonukleotydowe specyficzne dla genu

·          genotypowanie

·          wykorzystanie np. polimorfizmów związanych z występowaniem miejsc restrykcyjnych

·          wykrywanie rekombinantów

2.    Transfer Northern

a)    przebieg:

·          Analogicznie jak w przypadku Southern`a, tyczy się jednak RNA

·          sondą jest najczęściej cDNA

b)   zastosowanie:

·          badanie poziomu ekspresji genów

Mikromacierze

·          sonda na nośniku

·          każda kratka – 2 sondy (dla pewności wyniku)

·          wymiary: 1cm x 1cm -> 1064 sondy ^^

·          tworzenie: fotolitografia

·          znacząco przyspieszają analizy

·          odczyt wyników zautomatyzowany – poprawa rozdzielczości mikromacierzy pociąga za sobą rosnące potrzeby mocy obliczeniowych komputerów

FISH

Zastosowania:

·          lokalizacja ekspresji w tkankach

·          rozróżnianie homo- i heterozygot

·          mapowanie

·          wykrywanie transgenów