CYTOLOGIA ćw4.doc

CYTOLOGIA ćw.4                                                                                                                                            15.04.20011r.

Skład żelu do elektroforezy:

·         Żel agarozowy 2% (1g)

·         Bromek etydyny- używany do elektroforezy DNA

·         1xTBE (100ml)

Grzebień- słuzy do wyzanczenia miejsca nakładania prób- wkłada się w dowolne miejsce, ale najlepiej z boku- by było miejsce do rozejścia się prążka

Następnie żel polimeryzuje

Przygotowanie prób do nałożenia na żel : 4µl PCR produkt + 6µl H2O + 2µl Loading Dye = 12µl

Przygotowanie żelu : 1g agarozy + 100ml 1xTBE buffer + 5µl bromku etydyny

Próby DNA- są to próby po reakcji PCR

Wykrywanie obecności mutacji w wybranym genie:

1)     Izolacja DNA z tkanek zatopionych w parafinie

2)     Jakościowa i ilościowa analiza uzyskanego DNA

3)     Projektowanie starterów do określonej sekwencji DNA

4)     Amplifikacja wybranego fragmentu DNA z użyciem starterów (PCR)

5)     Elektroforeza agarozowa produktów PCR- pojedyncze paski

6)     Oczyszczanie produktu PCR z żelu agarozowego

7)     Enzymatyczne trawienie oczyszczonego produktu PCR

W jaki sposób wykryć mutacje?

Wybieramy gen (np. pochodzący z jelita) i wiemy, ze w danej jednostce chorobowej jest mutacja danego genu- np.  genu BRAF- będzie to mutacja przy C-końcu (dokładnie mutacja V600E)

Poziom ekspresji genu- postępowanie:

Ad. 1)

1.      Materiał z bloczka parafinowego- ścinamy ok. 10 fragmentów o grubości 5 µm
Materiał może pochodzić również z hodowli komórkowej- będzie to wtedy materiał świeży cytologiczny

2.      Izolacja DNA z tkanki- skrawki wkładamy do eppendorfów i łączymy je z buforem lizującym → następuje izolacja kwasu nukleinowego

Ad. 2)

1.      Analiza ilosciowa- wykrywa ilość DNA- metodą spektrofotometryczną

2.      Analiza jakosciowa- przeprowadzamy ją na żelu agarozowym
 

A- dobra jakość

1.     





Marker wielkości DNA                                 1       2       3

2.     





















2-3- próby DNA dobrej jakości

B- zła jakość
1. Marker wielkości                                                            1       2      3
2. 2,3- próby zdegradowanego DNA(smugi)

* nukleazy tną DNA w różnych miejscach-powstają małe cząsteczki i większe cząsteczki DNA → tworzy się smuga

Ad. 3)

1.      Ten etap jest potrzebny do wykonania później reakcji PCR

2.      Do projektowania starterów wykorzystuje się program internetowy: Primer3: WWW primer tool dostępny na stronie: http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi

3.      Projektowanie starterów do reakcji PCR→  PUB-MED- tam znajdują się wszystkie geny i sekwencje (wybiera się odpowiednią ilość nukleotydów, temperaturę itd.)

4.      Do wykonania reakcji PCR potrzebujemy:

·         DNA matrycowego

·         Polimerazy DNA

·         Nukleotydów

·         Buforu

5.      Startery musza się zaczynać w takim miejscu, aby okalać okolicę, w której występuje mutacja ( okalają to miejsce zarówno z prawej, jak i z lewej strony)

6.      Mutacja w jelicie V600E- zamieniony zostaje 600 aminokwas.
Zamieniona zostaje:               A→T  3’CAC→CTC5’
                                          T→A 5’GTG→GAG3’

Ad. 4) Przebieg reakcji PCR

+ polimeraza DNA             
+ dATP, dGTP, dCTP, dTTP

Reakcja PCR- zasada metody- 1. Cykl
 

Ogrzewanie              hybrydyzacja             
w celu               starterów                                                 synteza DNA
rozdzielenia                                                                            począwszy od startera
łańcucha                                            

Dwuniciowy DNA

ETAP:                                     1                                   2                                                                      3

ETAP:

1.      Ogrzewamy do 95oC- w celu rozerwania wiązań wodorowych pomiędzy dwuniciową cząsteczką DNA.

2.      Obniżamy temperaturę do ok. 50oC- wtedy możliwe jest przyłączenie starterów (kolor: żółty i zielony) Jeden starter do jednej nici, drugi do drugiej.

3.      Podgrzewamy próby do ok. 72oC- jest to temperatura optymalna do działania polimerazy.

4.      Następnie w drugim cyklu powtarzane są etapy 1,2 i 3, potem następuje kolejny cykl- itd. [przechodzimy przez ok 30-40 cykli]

5.      Ostateczny efekt- otrzymujemy cząsteczki wybranego genu BRAF DNA

6.      W pierwszym cyklu mamy 2 dwuniciowe cząsteczki DNA, w drugim mamy już 4 takie cząsteczki, w 3 będzie ich 8 itd.

Ad. 5)

Elektroforeza przeprowadzana jest na żelu agarozowym.
Produkty wycinamy z żelu skalpelem

Ad. 6)

Po otrzymaniu 6 prób- z każdej wycinamy skalpelem fragment tego żelu, który nam powstał. Następnie traktujemy to specjalnymi substancjami, które oczyszczą DNA. (KIT – rozpuszcza agarozę).

Trawimy fragment np. metodą RFLP albo odczytujemy nukleotydy sekwenatorem.

[Sekwenator - urządzenie, które odczytuje poszczególne fragmenty DNA]

RFLP:

·         metoda, która polega na cięciu restrykcyjnym z użyciem enzymów restrykcyjnych izolowanych z bakterii

·         cięcie kwasów nukleinowych w odpowiednim miejscu

·         cięta jest ciągle ta sama sekwencja

W wyniku trawienia – po elektroforezie, otrzymamy 2 prążki jeżeli w DNA nie będzie mutacji lub 3 prążki jeżeli będzie obecna mutacja.

W metodzie RFLP używa się specjalnych markerów, np. markerów wielkości – pokazują nam one jaką wielkość ma dany produkt. Izoluje się DNA faga λ i wybieramy enzymy restrykcyjne, które potną to DNA i uzyskamy prążki o znanej wielkości.

Mikrodysekcja- wycina się pojedyncze komórki
Komputer + laser - można zaznaczyć tylko te komórki, które nas interesują- laser wycina te komórki i przenosi je do ependorfa ( po hybrydyzacji In situ też można)- szkiełko zabarwia się przy użyciu H&E.
Potrzebne jest do tego kilka PCR- sekwencjonowanie- wykrywanie mutacji w wybranym genie- sekwencjonowanie

Określenie ilości transkryptu- zajmujemy się RNA!:

Określenie poziomu ekspresji genów w różnych tkankach- izolacja RNA, odwrotna transkrypcja do cDNA. Amplifikacja fragmentów badanego cDNA metodą PCR w celu zbadania poziomu ekspresji genów/ relatywnej ilości analizowanego tran skryptu- wyniki półilościowego RT-PCR

Reakcje PCR prowadzi się tylko na DNA! (polimerazy DNA nie będą działały na RNA)

Jeśli mamy do czynienia z RNA to musimy za pomocą odwrotnej transkryptazy zamienić go w cDNA :

RNA   odwrotna transkryptaza    DNA ( nazywane cDNA) * cDNA= mRNA bez uracylu

W badaniu poziomu ekspresji genu musimy dodać 4 startery : 2 normalne i 2 do aktyny (house-keeping gene = gen metabolizmu podstawowego, nie zawsze jest to aktyna)

InACT-4: wynik badania poziomu ekspresji aktyny
In2TL- badanie poziomu ekspresji genu badanego
 

Półilościowy- bo dokładnie nie można określić ilości genu, wynik podaje się w odniesieniu do aktyny

RT-PCR (real time PCR)- ilościowy PCR