POTRANSKRYPCYJNE WYCISZANIE GENÓW U ROŚLIN.pdf

Tom 53, 2004

Numer 2 (263)

Strony 193–200

M ARTA P APROCKA iM AGDALENA W OŁOSZYŃSKA

Zakład Biologii Molekularnej Komórki

Instytut Biochemii i Biologii Molekularnej, Uniwersytet Wrocławski

Przybyszewskiego 63/77, 51-148 Wrocław

e-mail: atilong@interia.pl

POTRANSKRYPCYJNE WYCISZANIE GENÓW U ROŚLIN

WSTĘP

Przedmiotem genomiki funkcjonalnej jest

badanie funkcji produktów ekspresji genów.

Jeszcze do niedawna ogromne nadzieje na roz-

wój tej dziedziny wiązano z możliwością se-

kwencjonowania genomów organizmów ży-

wych. Wydawało się, że poznanie pełnej infor-

macji genetycznej pozwoli na zrozumienie mo-

lekularnych podstaw funkcjonowania i rozwo-

ju organizmu. Obecnie wiemy, że odkrycie se-

kwencji nukleotydowych nawet wszystkich

genów jest jedynie wstępem do określenia

funkcji, jaką pełnią produkty ich ekspresji.

Jedną z metod wyjaśnienia roli pełnionej przez

białko jest mutageneza insercyjna, jej wadą jest

jednak czasochłonność i konieczność analizy

ogromnej liczby mutantów (K RYSAN i

współaut. 1999). Dobrą alternatywą dla tej me-

tody jest zahamowanie ekspresji genu ko-

dującego badane białko i analiza spowodowa-

nych tym zmian w fenotypie (K ISIEL i współaut.

2003). Ostatnio w genomice funkcjonalnej co-

raz częściej stosuje się wyciszanie ekspresji

genu na poziomie jego transkryptu. Proces ten

polega na degradacji mRNA badanego genu, in-

dukowanej przez dwuniciowy RNA (dsRNA),

homologiczny do sekwencji tego genu. Zjawi-

sko to, powszechne u wszystkich eukariontów,

u zwierząt znane jest jako interferencja RNA

(RNAi), u roślin jako potranskrypcyjne wyci-

szanie genów (PTGS), natomiast w przypadku

grzybów jako quelling . Coraz częściej jednak w

celu ujednolicenia terminologii, termin RNAi

stosuje się do określenia wyciszania zarówno u

zwierząt jak i u roślin (K USABA 2004). Specy-

ficzność sekwencyjna interferencji RNA jest

tak wielka, że wprowadzenie do komórki dwu-

niciowegoRNAoodpowiedniejsekwencjipo-

zwala na precyzyjne wyłączenie ekspresji wy-

branego genu. Ze względu na obszerność tema-

tu omówienie zależnego od homologii wyci-

szenia genów ograniczymy jedynie do głów-

nych aspektów potranskrypcyjnego wycisza-

nia genów u roślin.

Efektem RNAi jest degradacja mRNA odby-

wająca się w cytoplazmie. Jeżeli jednak dwuni-

ciowy RNA jest homologiczny do sekwencji

promotorowej genu, wyciszanie genów może

mieć miejsce również w jądrze komórkowym.

Proces ten jest wówczas definiowany jako tran-

skrypcyjne wyciszanie genów (ang. transcrip-

tional gene silencing, TGS) (S IJEN iK OOTER

2000).

Zainteresowanie potranskrypcyjnym wyci-

szaniem genów u roślin zostało zapoczątkowa-

ne zaskakującym wynikiem transformacji petu-

nii. U roślin Petunia hybrida próbowano zwię-

kszyć syntezę antocyjanów wprowadzając do-

datkową kopię genu syntazy chalkonowej

(P ACAK iB ARCISZEWSKA -P ACAK 2003). Oczeki-

wano, że rośliny transgeniczne będą posiadały

intensywnie fioletowe kwiaty. Tymczasem

transformacja wywołała efekt całkowicie od-

wrotny, kolor kwiatów nie tylko nie stał się

ciemniejszy, ale otrzymane rośliny posiadały

najczęściej kwiaty białe (H ANNON 2002). Zaob-

serwowane zjawisko nazwano kosupresją, czy-

194

M ARTA P APROCKA i M AGDALENA W OŁOSZYŃSKA

li procesem eliminacji zarówno mRNA wpro-

wadzonego genu , jak i jego endogennego od-

powiednika (S IJEN iK OOTER 2000, D ING 2000,

C HICAS iM ACIANO 2001, S ZWEJKOWSKA -

K ULIŃSKA i wpółaut. 2003). Okazało się, że mo-

lekularną podstawą kosupresji jest proces

RNAi.

Wyciszanie potranskrypcyjne zostało co

prawda odkryte u roślin otrzymanych w wyni-

ku transformacji, ale proces ten jest przede

wszystkim naturalnym mechanizmem obrony

roślin przed wirusami i wiroidami (F AGARD i

V AUCHERET 2000, L INDBO i współaut. 2001,

V IONNET 2001). Naturalnąroląwyciszaniajest

także regulacja poziomu ekspresji transpozo-

nów (B RANTL 2002, V IONNET 2002, K IDNER i

M ARTIENSSEN 2003).

CZYNNIKI ODPOWIEDZIALNE ZA INDUKCJĘ POTRANSKRYPCYJNEGO WYCISZANIA GENÓW

Sygnałem do uruchomienia wyciszania po-

transkrypcyjnego jest dla komórki roślinnej

pojawienie się długich dwuniciowych cząste-

czek RNA ( S IJEN iK OOTER 2000, M ATZKE i

współaut. 2001 ). Cząsteczki takie mogą poja-

wiać się w komórce w wyniku zakażenia wiru-

sami ( S ZWEJKOWSKA -K ULIŃSKA i wpółaut.

2003).

W przypadku wyciszania będącego skut-

kiem transformacji (kosupresja), induktorem

może być nie tylko dsRNA (S CHIEBEL i

współaut. 1998, S IJEN iK OOTER 2000 ).Wmo-

delu ilościowym rolę induktora pełni RNA zbu-

dowany prawidłowo, ale powstający w nad-

miernych ilościach w wyniku nadekspresji

transgenu (ang. treshold model) ( S IJEN i

K OOTER 2000) .Wmodelujakościowymnato-

miast, uruchomienie mechanizmu następuje

na skutek obecności abRNA (ang. aberrant),

powstającego po niewłaściwej obróbce RNA

lub na skutek powstania dsRNA (np. w wyniku

transkrypcji odwróconych powtórzeń) ( S IJEN i

K OOTER 2000, S CHIEBEL i współaut. 1998).

Bez względu na to jakie zdarzenie indukuje

wyciszanie genów, zawsze bierze w nim udział

nukleaza Dicer. Jeśli wyciszanie jest inicjowa-

ne bezpośrednio przez dsRNA nukleaza Dicer

powoduje fragmentację tych cząsteczek na

krótkie 21-22 nukleotydowe fragmenty, które

z kolei są całkowicie degradowane przez kom-

pleks RISC. Jeśli natomiast induktorem jest

abRNA, zbyt wysoki poziom RNA lub RNA wi-

rusa, aktywację nukleazy poprzedza działanie

polimeraz RNA generujących powstanie

cząsteczek dwuniciowych ( D ING 2000, S IJEN i

K OOTER 2000, L INDBO i współaut. 2001). Inter-

ferencja RNA stanowi zatem skomplikowaną

odpowiedź komórkową, obejmującą liczne i

nie do końca jeszcze wyjaśnione procesy.

MECHANIZMY INDUKCJI WYCISZANIA RNA — ETAP INICJACJI

INDUKCJA PRZEZ dsRNA — Dicer

które posiadają dwie domeny o aktywności hy-

drolitycznej, N-końcową domenę typu helika-

zy (zależną od ATP) oraz motywy wiążące RNA

(M OSS 2001, S HARP 2001, H ANNON 2002). Nu-

kleaza Dicer rozpoznaje dwuniciowe cząstecz-

ki RNA niezależnie od ich sekwencji (SHARP

2001). Aktywny kompleks generujący powsta-

nie siRNA jest dimerem posiadającym jedynie

dwa funkcjonalne centra aktywne, ponieważ

w każdym z monomerów działa tylko jedno

centrum nukleolityczne, podczas gdy drugie,

zlokalizowane centralnie, ulega inaktywacji

(H ANNON 2002) (Ryc. 1). Obecność siRNA jest

charakterystyczna dla wszystkich przypadków

interferencji RNA, bez względu na to, czy sta-

nowi odpowiedź na zakażenie wirusem, czy

transformację (S HARP 2001). Wśród siRNA zi-

dentyfikowano dwie populacje: krótsze, 21-22

nukleotydowe fragmenty, którym przypisuje

W warunkach laboratoryjnych najefektyw-

niejszym sposobem potranskrypcyjnego wyci-

szania genów jest transformowanie roślin wek-

torem zawierającym dwa przeciwnie zoriento-

wane powtórzenia transgenu rozdzielone in-

tronem (W ANG iW ATERHOUSE 2001, S MITH i

współaut. 2000). RNA, będący produktem eks-

presji takiej sekwencji, przyjmuje strukturę

dwuniciową.Takitranskryptjestrozpoznawa-

ny i hydrolizowany przez specyficzny kom-

pleks nukleolityczny. Produktem trawienia

dsRNA są krótkie, dwuniciowe siRNA (ang.

small interfering RNA). Głównym składnikiem

wspomnianego kompleksu jest nukleaza Dicer

odkryta po raz pierwszy u Drosophila melano-

gaster (M OSS 2001, E CKARD 2002). Jest to en-

zym zaliczany do rodziny rybonukleaz typu III,

Potranskrypcyjne wyciszanie genów u roślin

195

się kluczową rolę w degradacji mRNA oraz

dłuższe siRNA, zawierające od 24 do 26 nukle-

otydów, których rola zostanie omówiona w

dalszej części artykułu ( S ZWEJKOWSKA -

K ULIŃSKA i wpółaut. 2003 ,V IONNET 2002). To

Polimeraza cRdRP rozpoznaje jako niepra-

widłowe zarówno cząsteczki RNA krótsze lub

dłuższe od normalnego transkryptu, jak rów-

nież RNA zmodyfikowany chemicznie (np. po-

przez nieprawidłową poliadenylację) (C OGONI

Dicer

ATP

siRNA

dsRNA

Ryc. 1. Degradacja dsRNA przez kompleks enzymatyczny zawierający nukleazę Dicer.

Kompleks przyłącza się do dsRNA w sposób sekwencyjnie niespecyficzny. Jasnoszarym kolorem zaznaczono

funkcjonalne centra aktywne w podjednostkach dimeru nukleazy Dicer. Przy udziale ATP następuje pocięcie

dsRNA do siRNA. Pionowe strzałki wskazują miejsca cięcia dsRNA przez kompleks enzymatyczny.

właśnie odległość między funkcjonalnymi cen-

trami aktywnymi decyduje o wielkości po-

wstających dsRNA. Charakterystyczną cechą

obu populacji siRNA jest obecność dwóch nie-

sparowanych nukleotydów na 3’ końcach obu

nici. Taka struktura umożliwia połączenie

siRNA z pozostałymi składnikami kompleksu

enzymatycznego odpowiedzialnego za degra-

dację mRNA w dalszym, efektorowym etapie

wyciszania.

iM ACINO 2000, C HICAS iM ACIANO 2001,

M ATZKE i współaut. 2001). Substratem dla tego

enzymu może być także prawidłowo zbudowa-

ny mRNA, ale powstający w nadmiernej ilości,

jako efekt nadekspresji genu.

INDUKCJA PRZEZ WIRUSOWE RNA — vRdRP

Wspomniano wcześniej, że dwuniciowy

RNA pochodzenia wirusowego powoduje wy-

ciszanie genów. Oprócz wirusów posia-

dających genom w postaci dsRNA, wyciszanie

indukują również patogeny z genomem jedno-

niciowym (ssRNA) i wiroidy, u których dwuni-

ciowy RNA powstaje podczas replikacji. Synte-

za tego dwuniciowego produktu pośredniego

jest katalizowana przez wirusową zależną od

RNA polimerazę RNA (ang. viral RNA-depen-

dent RNA polimerase, vRdRP), kodowaną w ge-

nomie wirusa. Dwuniciowy RNA zostaje na-

stępnie rozpoznany przez komórkową nuklea-

zę typu Dicer i ulega hydrolizie do siRNA. Ana-

logicznie jak w poprzednich przypadkach na-

stępuje uruchomienie kaskady reakcji pro-

wadzących do degradacji jednoniciowego wi-

rusowego RNA i uwolnienia rośliny od patoge-

nu.

INDUKCJA PRZEZ abRNA — cRdRP

Zdarza się, że podczas transkrypcji, w wyni-

ku nieprawidłowej obróbki, powstaje abRNA.

Eliminacja takiego transkryptu przez wycisze-

nie wymaga jego konwersji do struktury dwu-

niciowej. Obecny w komórce abRNA zostaje

rozpoznany przez specyficzną, komórkową, za-

leżną od RNA, polimerazę RNA (ang. cell

RNA-dependent RNA polymerase, cRdRP). Po-

limeraza ta katalizuje syntezę niewielkich (do

100 nukleotydów) fragmentów RNA komple-

mentarnych do abRNA (D ING 2000, S IJEN i

K OOTER 2000, C HICAS iM ACIANO 2001,

M ATZKE i współaut. 2001, H ANNON 2002). Te

krótkie cząsteczki RNA noszą nazwę cRNA

(ang. complementary) (S CHIEBEL i współaut.

1998, S IJEN iK OOTER 2000, C HICAS iM ACIANO

2001, M ATZKE i współaut. 2001, W IŚNIEWSKA i

F ILIPECKI 2003). AbRNA, z dobudowanymi

cRNA, ma strukturę dwuniciową i stanowi sub-

strat dla nukleazy Dicer, która degraduje go do

krótkich siRNA w sposób opisany wcześniej.

Objawy fenotypowe potranskrypcyjnego

wyciszenia wirusa są dość specyficzne.

Początkowo roślina wykazuje symptomy cho-

roby spowodowane intensywną replikacją ge-

nomu wirusa w zakażonych komórkach. Jed-

nak po 7–21 dniach od zakażenia następuje za-

trzymanie tej akumulacji i roślina odzyskuje

196

M ARTA P APROCKA i M AGDALENA W OŁOSZYŃSKA

normalny fenotyp (B AULCOMBE 1999). Praw-

dopodobnie właśnie tyle czasu potrzeba go-

spodarzowi na rozpoznanie i zniszczenie pa-

togenu w procesie wyciszania. Jest to natur-

alny i być może jeden z najstarszych typów

oporności wirusowej. Udokumentowano wy-

ciszanie potranskrypcyjne wywołane takimi

wirusami,jakCaMV,TBRV,TRV,PVX(M A i

M ITRA 2002).

DEGRADACJA mRNA PRZEZ RISC — EFEKTOROWY ETAP WYCISZANIA GENÓW

Powstałe na skutek aktywności nukleazy

Dicer krótkie siRNA biorą następnie udział w

reakcjach prowadzących ostatecznie do degra-

dacji homologicznego mRNA. siRNA asocjują

z białkiem adaptorowym, helikazą i nukleazą

(C HICAS iM ACIANO 2001). Powstaje w ten spo-

sób rybonukleinowy kompleks wyciszający

(ang. RNA-induced silencing complex, RISC),

który rozpoznaje i niszczy docelowe cząsteczki

mRNA.

Obecne w kompleksie białko adaptorowe

bierze prawdopodobnie udział w transferze

siRNA z nukleazy Dicer (C HICAS iM ACIANO

2001). Rolą siRNA jest kierowanie asocjacją z

właściwym substratem. Uważa się, że identyfi-

kacja substratu następuje przez tworzenie par

typu Watsona–Cricka pomiędzy siRNA a frag-

mentem mRNA, ponieważ wyciszanie genu

wymaga identyczności sekwencji siRNA i doce-

lowego mRNA. Taki mechanizm zakłada ko-

nieczność rozplecenia dwuniciowych siRNA

przez znajdującą się w kompleksie helikazę.

Aktywny RISC może wówczas asocjować z do-

celowym mRNA, przy czym przecięcie mRNA

przez nukleazę zachodzi w rejonie komple-

mentarnym do siRNA w miejscu odpowia-

dającym środkowi siRNA (H UTVAGNER i

Z AMORE 2002, W IŚNIEWSKA iF ILIPECKI 2003,

C ULLEN 2004). Po oddysocjowaniu RISC po-

wstałe dwa fragmenty mRNA są degradowane

przez egzonukleazy komórkowe (C ULLEN

2004, H UTVAGNER iZ AMORE 2002) (Ryc. 2).

Jak widać, w potranskrypcyjne wyciszenie

genów zaangażowanych jest wiele rozmaitych

enzymów, w zależności od tego, czy indukcja

procesu zachodzi transgenicznie, czy wiruso-

wo. W tabeli zostały zebrane opisane enzymy

szlaku RNAi (Tabela 1).

siRNA

RISC

ATP

RISC*

mRNA

DEGRADACJA

Ryc. 2. Degradacja mRNA przez RISC; do kom-

pleksu nukleazy (NU), helikazy (HE) i białka ada-

ptorowego (BA) przyłączają się siRNA, tworząc

RISC.

Po aktywacji przez ATP cząsteczki siRNA ulegają roz-

pleceniu, komleks asocjuje z mRNA i katalizuje jego

hydrolizę.

AMPLIFIKACJA I TRANSMISJA POTRANSKRYPCYJNEGO WYCISZANIA GENÓW

Jedną z najbardziej zaskakujących obserwa-

cji dokonanych podczas badań interferencji

RNA jest fakt, że nawet bardzo niewielkie ilości

dsRNA w komórce powodują niemal 100% wy-

ciszenie. Dzieje się tak, ponieważ sygnał wyci-

szania indukowany przez dsRNA może ulegać

Potranskrypcyjne wyciszanie genów u roślin

197

amplifikacji. W opisany uprzednio sposób po-

jawienie się dsRNA prowadzi do powstania

cząsteczek siRNA. Cząsteczki te mogą być na-

stępnie wykorzystywane nie tylko bezpośred-

nio do wyciszania genów, ale również mogą

służyć jako startery dla komórkowej RdRP, któ-

ra katalizuje syntezę nowych dsRNA. W ten

siRNA w przenoszeniu sygnału, przy czym od-

powiednim kandydatem do pełnienia tej funk-

cji wydają się być dłuższe, 24-26 nukleotydowe

siRNA. Cząsteczki te są na tyle długie, aby

wiązanie z mRNA było specyficzne i jednocze-

śnie wystarczająco krótkie, żeby móc swobod-

nie przechodzić przez plazmodesmy. Jednak

Tabela 1. Zestawienie enzym ó wuczastnicz ą cych w potranskrypcyjnym wyciszeniu genów u roślin.

Enzym

Składniki kompleksu

Funkcja

Dicer

dimer RNazy III

rozpoznanie i trawienie dsRNA do siRNA;

cRdRP

komórkowa zależna od RNA po-

limeraza RNA

synteza cRNA na matrycy abRNA

vRdRP

wirusowa zależna od RNA po-

limeraza RNA

synteza dsRNA na matrycy ssRNA w cyklu replik-

acyjnym wirusa;

RISC

kompleks rybonukleoproteinowy

(nukleaza, helikaza RNA, białko

adaptorowe, siRNA)

hydroliza mRNA homologicznego do siRNA

sposób pula dsRNA w komórce ulega zwielo-

krotnieniu.

Gen ulega wyciszaniu nie tylko w komór-

kach, do których wprowadzono dsRNA, ale

również w komórkach z nimi sąsiadujących

oraz w znacznie oddalonych (M LOTSHWA i

współaut. 2002, S IJEN iK OOTER 2000). Dlatego

też zasugerowano istnienie specyficznego sys-

temu przenoszenia sygnału (transmisji) po-

przez plasmodesmy oraz floem ( L INDBO i

wspłaut. 2001, S ZWEYKOWSKA -K ULIŃSKA i

współaut. 2003). Zjawisko przenoszenia wyci-

szanianadalekiedystanseokreślasięjakowy-

ciszanie systemiczne (ang. systemic acquired

silensing, SAS) (S IJEN iK OOTER 2000). Jak

wspominaliśmy, wyciszanie jest procesem bar-

dzo specyficznym. Specyficzność jest zachowa-

na podczas transmisji systemicznej, niezale-

żnie od typu komórek. Dlatego uważa się, że

czynnikiem dyfuzyjnym może być jedynie

kwas nukleinowy (M LOTSHWA i współaut.

2002). Mimo że jego struktura pozostaje nie-

znana, zaproponowano kilka rodzajów cząste-

czek RNA, które potencjalnie mogą być odpo-

wiedzialne za transmisję (M LOTSHWA i

współaut. 2002). Jeden z modeli zakłada udział

argumentem przeciwko udziałowi siRNA w

transmisji wyciszenia jest fakt, że inaktywacja

nukleazy Dicer, generującej powstanie siRNA,

nie ma wpływu na przekazanie sygnału do ko-

mórek sąsiednich (C HICAS iM ACIANO 2001,

M LOTSHWA i współaut. 2002). Efektywnym

czynnikiem dyfuzyjnym mogłyby być również

cząsteczki cRNA powstające przy udziale poli-

merazy RdRP. Za prawdziwością tego modelu

przemawia fakt, że inaktywacja polimerazy ob-

jawia się zablokowaniem transmisji (C HICAS i

M ACIANO 2001, M ATZKE i współaut. 2001).

Liczne eksperymenty dowodzą istnienia w

roślinach mechanizmu transportu dłuższych

fragmentów RNA (M LOTSHWA iwspółau.

2002). Rośliny wytwarzają specjalne białka

funkcjonujące jako nośniki RNA i odpowie-

dzialne za przenoszenie genomu wirusów mię-

dzy komórkami, dlaczego więc w analogiczny

sposób nie mogłyby być przenoszone indukto-

ry wyciszania? W tym przypadku ruchomym

czynnikiem wyciszającym mógłby być nawet

abRNA, znacznie większy od wspomnianych

siRNA oraz cRNA (M LOTSHWA i współaut.

2002).

WIRUSOWE SUPRESORY WYCISZENIA RNA

Krokiem milowym w poznaniu mechani-

zmu i funkcji potranskrypcyjnego wyciszania

genów u roślin było odkrycie w 1998 roku wi-

rusowych białek inaktywujących interferencję

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: