Analizy molekularne DNA i RNA w wykrywaniu dziedzicznych predyspozycji do nowotworów.pdf

Analizy molekularne DNA i RNA w wykrywaniu dziedzicznych predyspozycji

do nowotworów

Grzegorz Kurzawski

W ostatnich latach zidentyfikowano szereg genów, których mutacje odpowiedzialne są za

wysoką dziedziczną predyspozycję do nowotworów (1).

U nosicieli mutacji tych genów ryzyko zachorowania na chorobę nowotworową może

wynosić nawet 90%. Wybrane geny związane z predyspozycją do nowotworów dziedzicznych i

najczęściej badane w praktyce lekarskiej zestawiono w tabeli 1.

Opracowano szereg metod molekularnych, które pozwalają na wykrywanie mutacji .

Można je podzielić na metody:

I Bezpośredniego

II Pośredniego wykrywania mutacji

Ad. I . Bezpośrednie wykrywanie mutacji jest najbardziej swoistą metodą wykrywania zaburzeń w

obrębie genu. Umożliwia rozpoznanie nosicielstwa mutacji niemal ze 100% pewnością.

Ad. II. Pośrednie wykrywanie mutacji jest metodą o nieco mniejszej swoistości pozwala natomiast

na potwierdzenie lub wykluczenie nosicielstwa mutacji w wielu przypadkach, w których nie można

wykryć zmian bezpośrednio w genach.

Metody wykrywania mutacji klasyfikowane są również w zależności od tego, czy służą do

diagnozowania mutacji nieznanych czy też znanych i powtarzalnych, ze względu na zasadnicze

różnice w czułości identyfikowania i efektywności ekonomicznej.

Wykrywanie nieznanych mutacji

Zastosowanie technik wchodzących w skład tych metod w odpowiednio dobranych pod

względem cech rodowodowo-klinicznych przypadkach jest w praktyce lekarskiej uzasadnione

mimo tego, że techniki te jak dotychczas są złożone, pracochłonne i kosztowne.

I. Techniki bezpośredniego wykrywania nosicielstwa mutacji

1. Analizy DNA

Zasadnicze rodzaje analiz:

1a / izolacja DNA

1b / amplifikacja fragmentów genów, z reguły sekwencji kodujących

1c / wstępne wykrywanie zaburzeń w produktach amplifikacji technikami

przesiewowymi

1d / sekwencjonowanie

1e / metoda Southerna

Ad. 1a . Materiał do izolacji DNA stanowią na ogół komórki łatwo dostępne, takie jak leukocyty

z krwi obwodowej lub rzadziej bioptaty innych tkanek. W trakcie analiz wykrywana jest mutacja

konstytucyjna, a więc obecna we wszystkich komórkach pacjenta. Materiał do badania najlepiej

pobrać bezpośrednio przed izolacją, ale dobre wyniki uzyskuje się również po kilkudniowym prze-

chowywaniu krwi w temperaturze pokojowej lub nawet przez kilka lat w temperaturze poniżej ze-

ra. Jeżeli nie dysponujemy tkankami świeżymi to izolację DNA można wykonać z tkanek utrwalo-

nych w formalinie i zatopionych w bloczkach parafinowych, chociaż uzyskanie jednoznacznych

wyników z takiego materiału jest trudne, niekiedy wręcz niemożliwe. Izolowanie DNA polega na

usunięciu białek z lizatu komórkowego. Zwykle uzyskuje się to poprzez trawienie proteinazą K i

ekstrakcji w mieszaninie fenolu i chloroformu. Z odbiałczonych w ten sposób próbek kwasy nu-

kleinowe wytrąca się alkoholami: etylowym lub izopropylowym.

Ad. 1b. W tej analizie powielane są fragmenty badanego DNA za pomocą reakcji łańcuchowej

polimeryzacji

. W skład mieszaniny reakcyjnej wchodzą: matryca DNA (zwykle genomowe

DNA), polimeraza DNA, para specyficznych starterów („primers”), trójfosforany deoksyrybonu-

kleotydów oraz bufor reakcyjny. Mieszanina ta poddawana jest w specjalnym termostacie cyklicz-

nym zmianom temperatury. Każdy cykl składa się z trzech etapów: denaturacji, przyłączania star-

terów i syntezy. Po 22 cyklach, przy 100% wydajności, liczba kopii powielanego fragmentu zwi-

ększa się milion razy.

(PCR)

Ad.1 c. Najbardziej popularną techniką wstępnego wykrywania zaburzeń w produktach ampli-

fikacji jest badanie zmian konformacji jednoniciowego DNA -SSCP (single stranded confor-

mational polymorphism) (7).

Z szeregu innych stosowanych technik do częściej używanych zaliczyć można analizę hete-

rodupleksów – HET (heteroduplex analysis) (8), chemiczne rozszczepianie niesparowań hete-

rodupleksów - CMC (chemical mismatch cleavage) (9) i elektroforezę na żelach z gradientem

czynnika denaturującego -DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) (10).

SSCP - badanie zmian konformacji jednoniciowego DNA

Technika ta opiera się na tym, że jednoniciowe DNA w roztworze wykazuje określoną

strukturę drugorzędową. Struktura ta zależy od rodzaju i sekwencji zasad tworzących nić DNA.

Mutacje punktowe, delecje i insercje powodują zmiany struktury drugorzędowej, która wpływa na

szybkość poruszania się nici w trakcie elektroforezy na niedenaturujących żelach poliakrylamido-

wych. Nici normalne i zmutowane wykazują odmienną ruchliwość elekroforetyczną (rys.1 i 2). W

ostatnich latach wprowadzono szereg udoskonaleń tej techniki, dzięki którym można wykonać

analizę na gotowych żelach w kontrolowanej temperaturze, a barwienie żeli (srebrzenie) zostało

całkowicie zautomatyzowane. Cała procedura trwa niespełna dwie godziny. Do zalet tej analizy

należy również to, że startery zsyntetyzowane do SSCP mogą być równocześnie stosowane do

sekwencjonowania, analizy heterodupleksów oraz chemicznego rozszczepiania niesparowań hete-

rodupleksów. Niedogodności SSCP to przede wszystkim konieczność analizowania produktów

PCR nie dłuższych niż 200-300 pz (par zasad), bowiem przy większej długości produktów spada

znacząco czułość wykrywania mutacji. Dlatego by ocenić sekwencję kodującą dużych genów

trzeba wykonać wiele reakcji PCR, np. gen BRCA1 należy analizować poprzez badanie 40

różnych produktów amplifikacji. Wielu autorów podkreśla, że czułość SSCP w wykrywaniu muta-

cji nie przekracza 80% (11).

HET - analiza heterodupleksów

HET podobnie jak SSCP jest techniką względnie prostą. Jeżeli sekwencje niezmienione

(typu dzikiego) oraz sekwencje z mutacją są obecne w reakcji PCR (jako matryce) to produktami

tej reakcji są cztery różne dwuniciowe fragmenty DNA (rys.3). Dwa z nich to homodupleksy ,

czyli struktury dwuniciowe w pełni komplementarne. Dwa inne to heterodupleksy zawierające

miejsca niesparowane (mismatch) . Heterodupleksy ze zmianą co najmniej jednej zasady mogą wy-

kazywać inną w porównaniu do homodupleksów ruchliwość podczas elektroforezy na zwykłym

poliakrylamidowym żelu. Czułość tej analizy w wykrywaniu mutacji nie jest dobrze znana. Szacuje

się, że w niektórych układach doświadczalnych może wynosić nawet 90% (8). Według niektórych

autorów stosując HET można wykrywać niekiedy zaburzenia genów, które nie są wykrywane

przez SSCP. Ponieważ reakcje PCR do HET i SSCP są takie same, a różnica w wykonaniu

doświadczeń pomiędzy technikami sprowadza się jedynie do różnej obróbki produktów ampli-

fikacji, wielu autorów proponuje stosowanie w każdym przypadku zarówno HET jak i SSCP ce-

lem zwiększenia czułości wykrywania mutacji stosunkowo niewielkim kosztem (12). Ostatnio

ukazało się szereg prac opisujących zastosowanie wysokosprawnej chromatografii cieczowej do

wykrywania mutacji (13,14,15,16,17). Technika zwana denaturującą wysokosprawną

chromatografią cieczową - DHPLC

jest

odmianą HET wykorzystująca wysoką rozdzielczość nowoczesnych wypełnień kolumn

chromatograficznych. Z dostępnych danych literaturowych (18) i badań własnych (19) wynika że

DHPLC łączy zalety dotychczas stosowanych metod. Czułość metody sięga 100% (14,16,17) przy

stosunkowo niskich kosztach (koszt odczynników najwyżej 20 złotych na próbkę) jest szybka, a

przy zastosowaniu „autosamplera” pozwala wykonać analizę 200 próbek na dobę.

CMC - chemiczne rozszczepianie niesparowań heterodupleksów

Zamiana nukleotydów w wyniku mutacji prowadzi do tego, że heterodupleksy powstające

w wyniku reakcji PCR mają miejsca niesparowania, w których złamana jest reguła, że w strukturze

dwuniciowego DNA naprzeciwko C znajduje się G i tworzy potrójne wiązanie wodorowe, a

komplementarnie do A znajduje się T tworząc podwójne wiązanie wodorowe. Niesparowane w

heterodupleksach zasady C i T ulegają chemicznej modyfikacji, odpowiednio z hydroksyloaminą i

czterotlenkiem osmu. Miejsca wiązania tych substancji są cięte z użyciem piperydny. Pocięte frag-

menty DNA są rozdzielane elektroforetycznie (rys.4). Zaletą metody jest niezwykle wysoka czuło-

ść bliska 100%, a także możliwość wykrywania mutacji w odcinkach DNA długości 1-2 kpz

(tysięcy par zasad) (11). Główną wadą techniki jest toksyczność chemikaliów, jak i większa złożo-

ność procedury w porównaniu z SSCP czy HET.

DGGE - elektroforeza na żelach z gradientem czynnika denaturującego

W trakcie elektroforezy dwuniciowego DNA w żelu o wzrastającym stężeniu związku

(Denaturing High-performance Liquid Chromatography

)

denaturującego (formamid, mocznik) niektóre fragmenty DNA ulegają rozdzieleniu na pojedyncze

nici (denaturacja) przy niższym, a inne fragmenty przy wyższym stężeniu formamidu.

W momencie rozejścia się na pojedyncze nici ich przemieszczanie w żelu zostaje gwałtow-

nie przyhamowane. Moment denaturacji DNA zależy od jego budowy (składu zasad i długości).

Fragmenty zawierające mutacje „zatrzymują się” w żelu na ogół przy innym stężeniu czynnika

denaturującego aniżeli prawidłowe. Technikę tę cechuje bardzo wysoka, ponad 90% czułość wy-

krywania mutacji (18). Do wad należy potrzeba elekroforezy w specjalnym aparacie oraz koniecz-

ność syntetyzowania dodatkowych starterów bogatych w sekwencje GC ( GC clamp ), co zwięk-

sza znacznie koszty testów.

Ad.1d. Sekwencjonowanie

Sewencjonowanie jest najbardziej czułą techniką wykrywania zmian w materiale genetycz-

nym umożliwiającą jednocześnie ich pełną charakterystykę. W ostatnich latach znaczny postęp w

technologii sekwencjonowania osiągnięto poprzez wprowadzenie automatycznych aparatów do

sekwencjonowania, których funkcjonowanie oparte jest o fluorescencję wzbudzaną laserem.

Każdy z nukleotydów (A, C, G, T ) może być wyznakowany innym fluorochromem ( rys. 5). Naj-

bardziej dogodną techniką jest tzw. „Cycle Sequencing” (21). W trakcie badania oceniane są

sekwencje produktów PCR obu nici DNA. Rzeczywista zmiana w odróżnieniu od artefaktów wy-

krywana jest w obu niciach (rys. 6). Procedura sekwencjonowania składa się z kilku etapów:

1. preparatywnego PCR - polegającego na namnożeniu wybranego fragmentu genu przy użyciu

pary specyficznych starterów;

2. asymetrycznego PCR - dla każdej próbki amplifikacja osobno z każdym ze starterów z za-

stosowaniem dideoksynukleotydów znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi;

3. elekroforezy na denaturującym żelu poliakrylamidowym z równoczesną detekcją i rejestracją

przepływających produktów;

4. analizy otrzymanych wyników przy użyciu pakietu programów komputerowych.

Podczas asymetrycznego PCR powstają wszystkie możliwe, różniące się długością oli-

gonukleotydy komplementarne do matrycy i zawierające na 3’-końcu fluorochrom („zaznaczone

kolorem”). Zostają one rozdzielone podczas elektroforezy od najkrótszego po najdłuższy, a kolej-

ność kolorowych nukleotydów odczytana jako sekwencja komplementarna do matrycy. Stwier-

dzana sekwencja DNA jest później porównywana z sekwencją prawidłową z dostępnych baz

danych takich jak GenBank i EMBL. Przez porównanie z sekwencjami prawidłowymi określany

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: