II-Test Amesa.doc

Test Ames’a. Wprowadzenie do genetyki bakterii.

Część teoretyczna:

Wprowadzenie do genetyki bakterii.

Bakterie - najprostsze, prokariotyczne organizmy jednokomórkowe, występujące we wszystkich środowiskach, nawet w tych, w których inne organizmy nie są w stanie przeżyć, są to organizmy kosmopolityczne.

Cechy genomu prokariotycznego:

·         Jego wielkość jest poniżej 5Mb, np. Escherichia coli – 4,64Mb, Mycoplasma genitalium – 0,58Mb, ale są tez wyjątki, np. Bacillus megaterium – 30Mb

·         Generalnie mają mniej genów niż eukarioty, np. E.coli – 4397

·         Genomy są bardziej zwarte w porównaniu z eukariotycznymi

·         Stanowi je przede wszystkim kolista, superskręcona, pojedyncza cząsteczka DNA, zlokalizowana w nukleoidzie tzw. „chromosom bakteryjny”, ale genom liniowy posiadają np. Borrelia burgdorferi, Streptomyces

·         Dodatkowe geny mogą znajdować się na kolistych lub liniowych cząsteczkach DNA – plazmidach

·         Z wyjątkiem Archaea nie występują geny nieciągłe (składające się z egzonów i intronów)

·         U prokariota geny zorganizowane są w operony (Rys. 1)

·         Rzadko występują sekwencje powtarzające się

·         Mogą zawierać sekwencje insercyjne – transpozony, które zdolne są do przemieszczania się w genomie i przenoszenia z jednego organizmu do drugiego, czasem nawet dwóch odrębnych gatunków

·         Wiele genomów bakterii jest już w pełni zsekwencjonowanych, np. Escherichia coli, Helicobacter pylori, Bacillus subtilis, Borrelia burgorferi, Treponema pallidum

Operon - grupa genów, które położone są obok siebie w genomie, najczęściej zaangażowanych w jeden szlak biochemiczny, które wspólnie podlegają ekspresji. Jednostka transkrypcji u Prokariota. Najbardziej znany przykład to operon laktozowy u E. coli – pierwszy odkryty operon (Jacob i Monod, 1961).

Rys. 1. Zasada działania operonu laktozowego u E. coli. System jest wyłączony, gdy brak jest laktozy (a). System ulega odblokowaniu w obecności laktozy (b).

Test Ames’a

Niektóre związki chemiczne mają działanie mutagenne, oznacza to, że kontakt z nimi może spowodować uszkodzenia DNA a tym samym mutację. Konsekwencją mutacji może być choroba nowotworowa, w takim przypadku związki te nazywane są kancerogenami.

W wielu gałęziach przemysłu (spożywczym, kosmetycznym, farmaceutycznym) niezwykle ważne jest badanie substancji pod kątem ich mutagenności. W tym celu wykorzystuje się wiele testów in vitro z użyciem bakterii lub komórek zwierzęcych rosnących w kulturach tkankowych. Jednym z często stosowanych jest test Amesa.

Test ten najczęściej przeprowadza się na kilku (specjalnie przygotowanych) szczepach Salmonella typhimurium. Są one mutantami auksotroficznymi z defektem w syntezie histydyny (mutacje w obrębie operonu histydynowego). Szczep his+ (szczep dziki) rośnie na podłożu bez histydyny, szczep his- (mutant) nie posiada zdolności do produkcji histydyny i wymaga jej obecności w podłożu. Test Ames'a ma za zadanie określić częstość rewersji (mutacji wstecznych = mutacji powrotnych) mutacji w operonie histydynowym, czyli częstość rewersji mutantów do formy prototroficznej, zdolnej do wzrostu na podłożu minimalnym, bez histydyny. Należy pamiętać, że niewielka część rewersji zachodzi spontanicznie. Dlatego ważne jest wykonanie kontroli, która pozwoli ocenić częstość rewersji spontanicznych, pozwoli to ocenić częstość rewersji zachodzących pod wpływem czynnika mutagennego.

Fenotyp mutanta może być wywołany przez mutacje różnego typu: delecje, insercje, substytucje, również substancje mutagenne wywołują różnego typu mutacje. Dzięki temu możliwe jest określenie nie tylko czy dana substancja jest mutagenna, ale także, jakiego typu mutacje wywołuje. Np. w przypadku szczepu z mutacją typu addycji, rewersja zajdzie wtedy, gdy badany związek będzie powodował mutacje typu delecji.

Taki sposób testowania związków chemicznych przeprowadza się nie tylko na typowym szczepie S. typhimurium, ale także na innych szczepach bakteryjnych, drożdżach i hodowlach tkankowych.

Niektóre związki stają się mutagenne dopiero w wyniku przemian metabolicznych zachodzących w wątrobie. Dlatego testuje się je w obecności enzymów wątrobowych.

Test Ames'a jest używany do identyfikowania zarówno pojedynczych związków mutagennych, jak i substancji będących mieszaniną związków. W olbrzymiej większości wykryte tym testem mutageny są również substancjami kancerogennymi dla ssaków. Przypuszcza się, że wykrywa się nim od 83 do 90% mutagenów.

Sposób przeprowadzenia

Na zajęciach testuje się mutagenność dwóch związków: azydku sodu i akryflawiny, na szczepach TA100 i TA96. Do płynnego agaru dodaje się odpowiedni szczep Salmonella typhimurium oraz badany związek we wszystkich kombinacjach (TA100+akryflawina, TA100+azydek sodu, TA96+akryflawina, TA96+azydek sodu), a następnie wylewa na podłoże minimalne Davise’a. Podłoże to jest wzbogacone o biotynę oraz zawiera śladowe ilości histydyny (po to, aby nastąpiły 2-3 podziały, gdyż mutageny działają na komórki dzielące się). Płytki inkubuje się w 370C przez 24 godziny. Bakterie rosną przez krotki czas, aż do wyczerpania histydyny. Po tym czasie jedynie komórki zdolne do wzrostu przy braku histydyny tworzą kolonie. Są to bakterie, u których zaszła rewersja (mutacja powrotna) i dlatego zdolne są do syntezy histydyny (stają się prototrofami (his+). Jeśli testowany związek nie jest mutagenem pojawić się może tylko kilka kolonii losowo rozsianych rewertantów spontanicznych. Jeżeli testowany związek jest mutagenem, wówczas liczba kolonii wzrasta (mutageneny indukują wzrastającą liczbę rewertantów) i są skupione w rejonie podłoża, gdzie umieszczono testowaną substancję (Rys. 1). Dodatkowo można uzyskać informacje jakiego typu mutacje powoduje badany związek. Szczep TA100 posiada mutację typu substytucji, związek który powoduje mutacje tego typu spowoduje powstanie rewertantów. Drugi szczep TA96 posiada mutację typu insercji, związek powodujący powstanie mutacji typu insercji lub delecji przywróci prawidłową ramkę odczytu i umożliwi powrót to fenotypu prototroficznego.

Rys. 1. Sposób przeprowadzenia testu Ames’a.

Cechy testu:

·         łatwy do wykonania

·         szybki (czas 48h)

·         czuły (wykrywanie nawet pojedynczych rewertantów)

·         tani

·         łatwy do oceny ilościowej

Dodatkowe cechy szczepów:

·         Mutacja rfa powoduje wzrost przepuszczalności bariery lipopolisacharydowej okrywającej powierzchnię bakterii, dzięki czemu związek mutagenny łatwiej może penetrować do wnętrza komórki.

·         Mutacja uvrB powoduje uszkodzenie systemu naprawiającego Zmiany wywołane przez związek mutagenny będą w mniejszym stopniu naprawiane, przez co zwiększy się wykrywalność mutagennego działania badanej substancji. Mutacja uvrB powoduje także defekt w operonie biotyny, przez co szczepy wymagają tej witaminy do wzrostu. Auksotrofia biotynowa jest więc markerem mutacji uvrB.

·         Plazmid oporności na antybiotyki pKM 101. Posiada on dodatkowo gen zmniejszający skuteczność działania systemu naprawiającego komórki.

Szczepy testowe mogą się różnić mutacjami powodującymi auksotrofię histydynową:

·         TA100 – mutacja hisG46 typu tranzycji GAG -> GGG, powoduje to zastąpienie leucyny -> proliną w pierwszym enzymie szlaku biosyntezy histydyny. Szczep stosuje się do wykrywania mutagenów powodujących substytucje np. azydek sodu. Szczep używany na ćwiczeniach.

·         TA98 – mutacja hisD3052 polegająca na wbudowaniu kilku dodatkowych par zasad w pobliżu początku genu dehydrogenazy histydynowej, co powoduje przesunięcie ramki odczytu (mutacja typu frame shift). Szczep stosuje się do wykrywania mutagenów powodujących delecje np. akryflawina. Szczep używany na ćwiczeniach.

·         TA96 – insercja kilku dodatkowych par zasad, co powoduje przesunięcie ramki odczytu. Szczep stosuje się do wykrywania mutagenów powodujących insercje i delecje.

·         TA1535 - substytucja G na A.

·         TA102 – insercja sekwencji TAA (kodon stop), powoduje zatrzymanie translacji.

Opracowanie: mgr Joanna Banaszak, dr Ewa Maciaszczyk

Część praktyczna:

1.      Kolokwium.

2.      Rozwiązywanie zadań: 36-38.

3.      Test Ames’a.

Szczepy bakterii Salmonella typhimurium

TA98                            hisD3052

TA 100              hisG46

Mutageny: Azydek sodu -  1,5 mg/ml (stężenia końcowe 15 mg/ml)

                     Akryflawina – 10 mg/ml (stężenia końcowe 100 mg/ml)

UWAGA!!! W czasie wykonywania doświadczenia należy zachować szczególną ostrożność !!!

DOŚWIADCZENIE

1.      Probówki zawierające 2 ml agaru (0.6% top agar) podgrzać do całkowitego rozpuszczenia agaru i przez czas prowadzenia doświadczenia przetrzymywać w temp. 45°C

2.      Agar lekko schłodzić (UWAGA!!!- nie dopuścić do zestalenia agaru), dodać 100 ml bakterii i 20  ml azydku sodu lub akryflawiny, dokładnie wymieszać, SZYBKO wylać na płytkę z podłożem MD (minimalne Davis’a) i równomiernie rozprowadzić po całej powierzchni płytki.

3.      Płytki inkubować 48h /37°C.

Szczepy i mutageny należy łączyć wg wskazań tabeli: