Patomorfologia 20.04.doc

Patomorfologia                                                                                                                              20.04.2010r.

Temat: Krojenie skrawków.

1. Mikrotom histologiczny – do cięcia preparatów zatopionych w parafinie i żywicach akrylowych

mikrotom

saneczkowy

rotacyjny

ręczny

automatyczny

ręczny

automatyczny

W mikrotomie saneczkowym porusza się nóż, w rotacyjnym – preparat. Mikrotom rotacyjny jest lepszy niż saneczkowy.

Zasada działania:

a)      przesuwanie preparatu (np. bloczka parafinowego) względem noża à m. rotacyjny

b)     przesuwanie noża względem preparatu à m. saneczkowy

Wyróżniamy też mikrotomy automatyczne, np. mikrotom automatyczny z przystawką mrożącą

* żywice akrylowe są lepsze do zatapiania niż parafina gdyż są twardsze i dzięki temu możemy cieniej kroić preparat.

* z bloczka parafinowego – skrawki 1 – 2 μm

* przy żywicach akrylowych skrawek 0,5 μm to już gruby skrawek, gdyż możliwe jest otrzymanie skrawków rzędu wielkość nm

* kąt noża musi być taki, aby równomiernie ścinać zatopiony materiał

2. Rodzaje noży w mikrotomach:

a)      stalowe – tylko dla skrawków z kriostatu oraz materiału zanurzonego w parafinie

b)     szklane – dla materiału zatopionego w żywicy – kroi się tym nożem skrawki półcienkie 0,5 μm

c)      diamentowe – histologiczne tną materiał zatopiony w parafinie, a także istnieją noże diamentowe do kriostatów (noże te nie tępią się, chyba, że zła prędkość w mikrotomie automatycznym, nieodpowiedni kąt cięcia i grubość)

tkanki:

półcienie à 0,5 μm

ultracienkie à 30nm

trymowanie – wycina się prostokąty lub trapezy wokół materiału tak aby skrawek był mały, podczas ścinania tej samej wielkości; w przypadku materiału świeżego lub parafinowego trymowanie to proces ścinania materiału/bloczku do momentu aż uwidocznimy całą tkankę.

3.  Szkiełka podstawowe

·         uzyskane skrawki umieszcza się na powierzchni wody, której temperatura jest nieco niższa nić temp. topnienia parafiny.

·         do barwienia H&E używa się skrawków grubości 5 – 6 μm

·         do barwienia H&E używa się szkiełek oczyszczonych i odtłuszczonych, na których umieszcza się skrawki

Jak odtłuścić szkiełko podstawowe?

Umyć detergentem z wodą à woda destylowana à umieścić na noc w alkoholu 95-96%

·         oprócz barwienia H&E na tych szkiełkach podstawowych możemy wykonywać barwienia, które nie wymagają długiego czasu preparatyki

·         czasem skrojone skrawki parafinowe naklejane są na szkiełka podstawowe pokryte:

- silanem

- poli – L – lizyną

- biobondem

- rzadziej nabiałkowane (już się niestosuje gdyż wyniki reakcji wychodziły zafałszowane, z powodu łączenia się antygenów nie tylko z materiałem badanym, ale także białkiem użytym do nabiałkowania szkiełka podstawowego)

Wymienione substancje zwiększają adhezyjność szkiełka. Szkiełka o podwyższonej adhezyjności stosuje się do reakcji immunohistochemicznych, barwień specjalnych i reakcji hybrydyzacji.

* trwałe przyklejenie skrawka otrzymuje się przez ogrzewanie gotowych preparatów w temp. 50oC przez kilka godzin (zwykle wystarczy czas od 40min do godziny)

* suszenie skrawków następuje poprzez odparowanie wody

* preparaty parafinowe à maksymalne grubości:

                            - do barwienia H&E                                                        6μm

                            - do immunohistochemicznych rekacji              4μm

                            - do hybrydyzacji in- situ                                          1-2μm

4. Materiał nieutrwalony – czyli do badania śródoperacyjnego

- mrożony w kriostacie (-30 oC , -40 oC )

- mrożony CO2 – suchy lód ( -60 oC )

- mrożony ciekłym azotem ( - 180 oC , -195 oC )

* im bardziej utrwalony materiał, tym cieńsze skrawki później możemy otrzymać.

* tkankę pobraną do badania śródoperacyjnego należy zamrozić a następnie skrawać przy użyciu mikrotomu zwanego kriostatem à mikrotom rotacyjny z komorą mrożącą

* szkiełka, na które będziemy nakładać skrawki również muszą być zmrożone, w przeciwnym razie z materiału zrobi nam się ‘ciapka’

( w przypadku materiałów zatopionych w żywicach syntetycznych otrzymujemy skrawki półcienie lub ultracienkie, a do cięcia stosujemy noże szklane lub diamentowe)

Temat: Techniki barwienia

1. Przygotowanie do barwienia à usunięcie parafiny i uwodnienie tkanki.

Po wykonaniu preparatów z materiału zatopionego w postaci bloczków parafinowych należy przygotować je do barwienia.

a)      Odparafinowanie skrawków

b)     Uwodnienie tkanek – konieczne, gdyż barwniki są rozpuszczalne w wodzie i nie mogą przeniknąć przez parafinę przepajając tkankę.

I etap

Odparafinowanie skrawków: skrawki naklejone na szkiełka podstawowe poddajemy:

·         wstępnej deparafinizaacji w temp. 60 oC przez noc

·         ostatecznej deparafinizacji w:

- ksylen I  (30min, 60 oC)

- ksylen II

(2-3min, temp. pokojowa)

- ksylen III

- ksylen IV

II etap

Uwodnienie

·         alkohol 99,8% (2-3 min)

·        

alkohol 96%                                                         alkohol 50% (2-3min w każdym)

·         woda destylowana (2-5min)

III etap

Barwienie

·         barwnik

2. Barwienie podstawowe H&E  <hematoksylina & eozyna>

Jest to barwienie przeglądowe pozwalające ocenić całość struktury tkanki, poprzez kontrastowe zabarwienie cytoplazmy i jąder komórkowych.

Hematoksylina – substancja naturalna, zasadowa, barwiąca jądra kom. na kolor fioletowy do niebieskiego

Eozyna – substancja syntetyczna, kwaśna, barwiąca cytoplazmę na różowo – do czerwonego

Barwienie H&E:

* od alkoholi rozpoczyna się proces ‘zamykania’ preparatu

* barwienie kończy się gdy wypłukujemy eozynę wodą destylowaną

* balsam kanadyjski nie rozpuszcza się w wodzie, jedynie w ksylenach, dlatego konieczne jest ponowne odwodnienie tkanki

* gdy preparat zamykamy w glicerynie – zaraz po barwieniu nanosimy kroplę gliceryny, nie musimy odwadniać tkanki, ponieważ gliceryna rozpuszcza się w wodzie

* minusem gliceryny jest to, że taki preparat nie jest trwały, zaletą np. fakt, że w przeciwieństwie do alkoholi nie rozpuszcza tłuszczy, dlatego też, gdy badamy tłuszcze preparat zamykamy gliceryną

Barwienie H&E: