ZNAKOWANIE W CELU WIZUALIZACJI WYNIKU.pdf

ZNAKOWANIE W CELU WIZUALIZACJI WYNIKU

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab4.html

ZAKOWAIE W CELU WIZUALIZACJI WYIKU

Wiele metod biologii molekularnej opiera się na wykorzystaniu wyznakowanych cząsteczek

kwasów nukleinowych. Dobra sonda powinna mieć wysoką aktywność , odpowiednią

czystość i specyficzność. Najpowszechniej wykorzystywane do znakowania są cząsteczki

nukleotydów, w których jeden z atomów zastąpiony został izotopem radioaktywnym.

Aktywność specyficzna zależy od proporcji włączonych nukleotydów radioaktywnych do

normalnych. Krótszy okres półtrwania izotopu również powoduje zwiększenie aktywności

specyficznej. Najczęściej stosowane są dwa izotopy : fosfor 32 P (włączany w pozycji a lub g

cząsteczki trifosforanu nukleotydu) oraz siarka 35 S (włączana w miejsce atomu tlenu

odpowiedniej reszty fosforanowej a lub g). Fosforu radioaktywnego używa się gdy

wymagane jest uzyskanie sondy o wysokiej aktywności co zapewnia dużą czułość i krótki

czas detekcji. Podstawowym zastosowaniem siarki jest sekwencjonowanie DNA a także

badanie metabolizmu białek.

ajczęściej używane radioizotopy.

Radioizotop

Czas

półtrwania

Energia emitowanych

cząstek (MeV)

Specyficzna aktywność

wyznakowanych składników

(mCi/mmol)

Tryt

12,35 lat

0,0186

10 2 10 5

Węgiel 14 5730 lat

0,156

1 10 2

Siarka 35 87,5 dnia

0,167

1 10 6

Fosfor 33 25,5 dnia

0,248

10 10 4

1 z 3

2010-04-04 13:27

ZNAKOWANIE W CELU WIZUALIZACJI WYNIKU

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab4.html

Fosfor 32 14,3 dnia

1,709

10 10 5

* MeV = 10 6 elektronowoltów. Powyżej podana maksymalna energia.

# mCi (miliCurie) miara liczby rozpadów na jednostkę czasu. 1 mCi = 2,2 . 10 9

rozpadów na minutę.

W zależności od konkretnego zastosowania stosuje się różne metody znakowania DNA :

ick translation DNaza I wprowadza do cząsteczki jednoniciowe pęknięcia (nick).

Polimeraza I dzięki swojej aktywności 5`3` egzonukleazy usuwa nukleotydy przed

sobą a za sobą dobudowywuje nowe włączając między innymi również nukleotydy

radioaktywne. W ten sposób przesuwa niejako miejsce pęknięcia. Wydajność

inkorporacji wynosi około 50%. Metoda ta daje najlepsze wyniki przy znakowaniu

całych plazmidów a nie jest raczej zalecana do fragmentów liniowych.

Random priming najczęstsza , oparta jest na hybrydyzacji oligonukleotydów (6 do

9 nukleotydów) o przypadkowej sekwencji do DNA , który ma być wyznakowany.

Następnie polimeraza Klenowa (fragment polimerazy DNA I nie posiadający

aktywności egzonukleolitycznej 5`3`) dosyntetyzowuje komplementarną nić DNA

poczynając od 3` OH końca przyłączonego startera. W mieszaninie reakcyjnej

znajdują się także radioaktywne nukleotydy włączane stopniowo do nowo

syntetyzowanej nici. Długość znakowanych fragmentów nie wpływa na wydajność

reakcji. Można w ten sposób uzyskać sondę o wysokiej aktywności. Metoda jest

doskonała zarówno do znakowania całych plazmidów jak i liniowych fragmentów.

Znakowanie DA na końcach.

Znakowanie 5` końca.

W tej metodzie używa się kinazy polinukleotydowej faga T4 , która przenosi grupę

fosforanową z pozycji g ATP na DNA lub RNA zawierające grupę hydroksylową na

5` końcu.

Ponieważ normalnie cząsteczki DNA zawierają grupę fosforanową na 5` końcu

należy przed znakowaniem poddać je działaniu alkalicznej fosfatazy , która

spowoduje jej usunięcie. Metoda najczęściej stosowana do znakowania syntetycznych

oligonukleotydów.

Znakowanie 3` końca.

Terminalna transferaza dołącza deoksyrybonukleotydy na 3` końcu. Nie wymaga

matrycy. Substratem dla tego enzymu może być zarówno jednoniciowe jak i

dwuniciowe DNA.

Wypełnianie lepkich końców. W tej metodzie używa się fragmentu Klenowa , który

dobudowuje brakujące na 3` końcu nukleotydy w cząsteczkach strawionych

enzymami restrykcyjnymi tworzącymi lepkie końce 5`. Wydajność inkorporacji sięga

niekiedy nawet 90%.

Po znakowaniu niezbędne jest oddzielenie niewłączonych radioaktywnych dNTP ,

2 z 3

2010-04-04 13:27

ZNAKOWANIE W CELU WIZUALIZACJI WYNIKU

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab4.html

które mogłyby ujemnie wpływać na jakość hybrydyzacji dając zbyt wysokie tło czyli

zmniejszając specyficzność reakcji. Rozdzielenie uzyskuje się przez sączenie na

kolumienkach ze specjalnym złożem , które zatrzymuje związki drobnocząsteczkowe

przepuszczając makrocząsteczki.

Ilościowe oznaczenie wyznakowania osiąga się przez pomiar aktywności sondy. Jest

on możliwy za pomocą dwóch urządzeń : licznika Geigera i licznika scyntylacyjnego .

Zliczają one zarejestrowane rozpady promieniotwórcze w jednostce czasu. Jednostką

podstawową jest cps (counts per second) zliczenie na sekundę lub dpm

(disintegrations per minute) liczba rozpadów promieniotwórczych na minutę.

Wykrywanie wizualne wyznakowanych cząsteczek w celu zlokalizowania prążka ,

który z sondą zhybrydyzował jest możliwe dzięki autoradiografii. Starszą metodą jest

poddanie naświetlaniu kliszy pokrytej emulsją fotograficzną czułą na

napromieniowanie w specjalnych kasetach. Klisza położona na filtr ulega

zaczernieniu w miejscu hybrydyzacji z sondą. Kasetę taką przechowuje się przez

pewnien czas , odwrotnie proporcjonalny do aktywności sondy , w temperaturze

70°C. Niska temperatura sprzyja ostrości prążków. Następnie klisza jest

wywoływana. Nowszą metodą jest ekspozycja filtru w innych kasetach. Jest tu

niezbędne specjalne urządzenie tzw. phosphoimager sprzężony z komputerem , który

umożliwia zeskanowanie powierzchni kasety i obróbkę uzyskanych w ten sposób

danych. Przy pomocy programu komputerowego Image Quant jesteśmy w stanie

oszacować nawet intensywność zaczernienia.

TECHNIKA WESTERN BLOT

ELEKTROFOREZA WĘDRÓWKA W ŻELU

3 z 3

2010-04-04 13:27

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: