ENZYMY
Enzymy są katalizatorami, które zwiększają szybkość reakcji chemicznej, same nie ulegając zmianie. W obecności enzymu szybkość reakcji znacznie wzrasta nawet do 107 razy. Reakcje katalizowane przez enzymy zazwyczaj przebiegają we względnie łagodnych warunkach (temp.<100 st.C, ciśnienie atmosferyczne, obojętne pH). Enzymy są zwykle wysoce specyficzne względem substratów, na które działają i produktów, które tworzą. Aktywność enzymatyczna może być regulowana, zmieniając się w zależności od stężenia substratów, lub innych cząst. Prawie wszystkie enzymy są białkami. Zidentyfikowano też kilka rodzajów cząst. RNA aktywnych katalitycznie.
Zmiany energii zachodzące w przebiegu reakcji biochemicznej:
Dla wszystkich reakcji istnieje bariera energetyczna, którą należy pokonać aby umożliwić przebieg reakcji. Jest to ilość energii potrzebna do przeprowadzenia cząst. substratu w stan przejściowy, który jest niestabilną formą chemiczną, prowadzącą od substratów do produktów. Stan przejściowy ma największą energię swobodną ze wszystkich związków w drodze reakcji. Energia aktywacji (∆G++) równa się różnicy energii swobodnej między stanem przejściowym, a substratem. Enzym działa w drodze stabilizowania stanu przejściowego reakcji chem. i zmniejsza ∆G++. Enzymy nie zmieniają poziomu energii zarówno substratu, jak i produktu. Enzym zwiększa szybkość przebiegu reakcji, ale nie wpływa na ogólną zmianę energii w tej reakcji. Zmiana energii swobodnej (Gibbsa) (∆G=kJ*mol-1) decyduje czy reakcja będzie energetycznie korzystna, czy niekorzystna. Reakcja energetycznie korzystna – tzn. produkty mają niższy poziom energii niż substraty, a wartość ∆G jest ujemna. ∆G jest pojęciem innym niż ∆G++. Wartość ∆G jest niezależna od drogi reakcji i nie dostarcza żadnej informacji o szybkości reakcji. O szybkości reakcji decyduje energia aktywacji (∆G++). Ujemna wartość energii swobodnej (∆G) wskazuje, że reakcja jest termodynamicznie korzystna we wskazanym kierunku (ma dużą szansę przebiegu spontanicznego), natomiast dodatnia wartość ∆G – reakcja jest niekorzystna termodynamicznie i wymaga nakładu energii, aby zajść we wskazanym kierunku. W układach biochemicznych ten nakład energii uzyskuje się często przez sprzężenie reakcji energetycznie niekorzystnej z reakcją energ. korzystną. Często jest korzystne odwoływanie się do wartości ∆G aktualnej dla standardowego zestawu warunków (tj. jednakowe stężenie [1M] zarówno substratów jak i produktów reakcji, stałe pH ≠ 7,0). W tych warunkach wartość stwierdzona dla ∆G jest nieco odmienna niż w innych warunkach i jest określana jako ∆G0’. Przykładem reakcji energ. korzystnej, o dużej ujemnej wartości ∆G0’ i często używanej do napędzania reakcji energ. niekorzystnych, jest hydroliza ATP, tworząca ADP i Pi. [ ATP + H2O à ADP + Pi ; ∆G0’= -30,5 kJ*mol-1 ].
Reakcja chemiczna istnieje zazwyczaj w stanie równowagi dynamicznej, w której mimo ustawicznego przekształcania się nowych cząst. substr. i tworzenia nowych cząst. prod., proporcja substratu do produktu pozostaje stała.
Rozważmy następującą sytuację: A à B [10-4s-1]; Aß B [10-6s-1]; gdzie szybkość reakcji w kierunku wprost (od A do B) wynosi 10-4 na sekundę, a szybkość reakcji w kierunku odwrotnym wynosi 10-6 na sek. W równowadze stosunek stężeń substr. i prod. stanowi wartość stałą, znaną jako stała równowagi (K). Stałą równowagi dla danej reakcji definiuje się jako: K=[produkty]/[substraty]=[B]/[A]; „[]” – stężenie. Stała równowagi jest określana przez stosunek szybkości reakcji w kierunku wprost (Kf) do szybkości reakcji w kierunku odwrotnym (Kb): K=Kf/KB=10-4/10-6=100. Dla tej reakcji w stanie równowagi istnieje 100x więcej produktu B niż substratu A, niezależnie od tego, czy enzym jest obecny, czy nie. Dzieje się tak dlatego, że enzymy nie zmieniają położenia równowagi reakcji, ale przyspieszają szybkość reakcji w obu kierunkach w tym samym stopniu. Enzymy przyspieszają osiągnięcie stanu równowagi, ale nie przesuwają jego położenia.
Miejsce aktywne enzymu jest regionem, który wiąże substrat i przemienia go w produkt. Zazwyczaj jest to względnie niewielka część całej cząsteczki enzymu i stanowi określoną trójwymiarową przestrzeń, utworzoną przez reszty aminokwasów, które w liniowym łańcuchu polipeptydowym mogą leżeć daleko od siebie. Miejsce aktywne jest często szczeliną lub zagłębieniem w cząst. enzymu, które tworzą środowisko w znacznym stopniu niepolarne, co ułatwia wiązanie substratów. Substr. jest wiązany w miejscu aktywnym przez liczne słabe siły (oddziaływania elektrostatyczne, wiązania wodorowe, siły Van der Waalsa, oddział. hydrofobowe), a w pewnych przypadkach przez odwracalne wiązania kowalencyjne. Po związaniu cząst. substratu i utworzeniu kompleksu enzym – substrat, katalitycznie czynne reszty w obrębie miejsca aktywnego enzymu działają na cząst. substratu tak, aby przekształcić go początkowo w stan przejściowy, a następnie w produkt, który zostaje uwolniony do roztworu. Potem enzym, już wolny, może związać kolejną cząst. substratu i rozpocząć nowy cykl katalityczny.
Zaproponowano dwa modele wyjaśniające jak enzym może związać swój substrat : (1) model zamka i klucza – Fischer 1894 – kształt substratu i aktywnego miejsca enzymu miałby pasować do siebie jak klucz do zamka; oba kształty są sztywne i utrwalone oraz pasują do siebie idealnie po odpowiednim zestawieniu; (2) model indukowanego dopasowania – Koshland 1958 – związanie substr. indukuje zmianę konformacyjną w aktywnym miejscu enzymu; enzym może zniekształcać substrat wymuszając w nim konformację podobną do stanu przejściowego (np. związanie glukozy z heksokinazą indukuje taką konformacyjną zmianę w strukturze enzymu, że jego miejsce aktywne przyjmuje kształt komplementarny do substratu (glukozy) tylko po jego związaniu z enzymem). Różne enzymy wykazują cechy charakterystyczne dla obu modeli, a więc pewną komplementarność i pewne zmiany konformacji.
SPECYFICZNOŚĆ SUBSTRATOWA
Właściwości ułożenia przestrzennego reszt aminokwasów tworzących aktywne miejsca enzymu determinują rodzaj cząsteczki, która może zostać związana i stać się substratem dla tego enzymu. O specyficzności substratowej często decydują zmiany stosunkowo niewielkiej liczby aminokwasów w miejscu aktywnym. Widać to wyraźnie w trzech enzymach trawiennych (trypsynie, chymotrypsynie, elastazie). Te 3 enzymy należą do rodziny enzymów o nazwie proteazy serynowe – „serynowe”, ponieważ mają w miejscu aktywnym resztę seryny, której udział w katalizie jest krytyczny; „proteazy”, ponieważ katalizują hydrolizę wiązań peptydowych w białku. Te 3 enzymy rozszczepiają wiązania peptydowe w białkowych substratach, po karboksylowej stronie pewnych reszt aminokwasów. Trypsyna rozszczepia (tnie) po karboksylowej stronie dodatkowo naładowanych reszt Lys lub Arg. Chymotrypsyna – po karboksylowej stronie dużych reszt aminokw. aromatycznych i hydrofobowych; elastaza – po karboksylowej str. reszt o krótkich, nienaładowanych łańcuchach bocznych. Różnica specyficzności tych enzymów jest narzucana przez charakter grup aminokwasów w miejscach wiązania substratu, komplementarnych względem substratu, na który działają. Tak więc trypsyna ma w swoim miejscu wiązania substratu ujemne naładowaną resztę ASP, która oddziałuje z dodatnimi ładunkami Lys i Arg substratu. Chymotrypsyna ma w miejscu wiązania substr. reszty aminokwasów o krótkich łańcuchach bocznych, tj. Gly i Ser, co umożliwia wejście do tych miejsc dużych łańcuchów bocznych substratu. Elastaza ma względnie duże, nienaładowane boczne łańcuchy aminokwasów Wal, Thr, wystające do miejsca wiązania substr., co pozwala na wejście do tego miejsca wyłącznie krótkich łańcuchów bocznych Gly i Ala substratu.
SPECYFICZNOŚĆ KIERUNKU DZIAŁANIA ENZYMÓW
Swoistość kierunku działania polega na zdolności enzymu do katalizowania tylko jednej z termodynamicznie możliwych reakcji, jakim może podlegać substrat wchodzący z nim w kompleks. Jeżeli dany substrat może przekształcić się w kilku różnych kierunkach, każda z reakcji jest katalizowana przez odrębny enzym zdolny do przekształcania wiązania określonego typu. Np. dowolny aminokwas ulega przemianom w co najmniej trzech kierunkach, każda z reakcji jest katalizowana przez inny enzym: dehydrogenazę, dekarboksylazę, aminotransferazę. Dwa ostatnie współdziałają z tym samym koenzymem – fosforanem pirydoksalu. Co jest dowodem, że swoistość kierunku działania jest funkcją części białkowej enzymu, a w mniejszym stopniu wiąże się z koenzymem.
Specyficzność działania enzymów na przykładzie 3 typów przemian aminokwasów:
transaminaza
+ HOOCCH2COCOOH
(kw.szczawiooctowy)
CH2NH3+ COO- COO- COO-
dekarboksylaza
-CO2
CHNH3+
(CH2)2 CO + CHNH3+
COO- (CH2)2
Kwas gamma- (CH2)2 CH2
aminomasłowy COO- COO-
kwas glutaminowy COO-
kw. alfa-keto- kw. aspara-
dehydrogenaza
-2H, +H2O
glutarowy ginowy
COO-
CO + NH3
(CH2)2
kw.alfa-keto-
glutarowy
Zmiany energii zachodzące podczas przebiegu reakcji biochemicznej:
1.model klucza i zamka
2.model indukowanego dopasowania
Schemat miejsc wiążących substrat w proteazach serynowych:
Czynniki wpływające na aktywność enzymów:
1.Oznaczanie enzymów. Ilość obecnego białka enzymatycznego można oznaczyć mierząc uzyskany efekt katalityczny, a więc ilość substratu przetworzonego w produkt. Aby oznaczyć enzym (mierząc jego aktywność) musimy znać sumaryczne równanie katalizowanej reakcji i dysponować procedurą analityczną umożliwiającą określenie albo ubytku substratu, albo pojawienie się produktu. Poza tym należy wziąć pod uwagę czy enzym wymaga jakichś kofaktorów oraz znać pH i temp., w której enzym jest optymalnie aktywny. Dla enzymu ssaków optimum takie przypada zazwyczaj na 25-37st.C. Istotne jest również, aby mierzona szybkość reakcji stanowiła miarę badanej aktywności enzymatycznej i nie była ograniczona niedostatecznym dopływem substratu. Dlatego też, zwykle są konieczne duże stęż. Substratu, tak, aby początkowa szybkość reakcji, którą właśnie mierzy się doświadczalnie była proporcjonalna do stęż. enzymu. Zazwyczaj enzym oznacza się przez pomiar szybkości pojawienia się produktu, lub szybkości zużywania substratu. Jeśli substrat, lub produkt absorbuje światło o specyficznej dł.fali, to zmiany stęż.tego związku można mierzyć śledząc zmianę absorbancji przy tej dł.fali, dokonuje się to zazwyczaj za pomocą spektrofotometru. Ponieważ absorbancja jest w pewnym zakresie proporcjonalna do stęż., szybkość zmiany absorbancji jest proporcjonalna do aktywności enzymu wyrażonej w molach zużytego substratu (lub wytworzonego produktu) w jednostce czasu. Cząsteczkami najczęściej używanymi do pomiarów absorbancji, w celu oznaczania enzymu są 2 koenzymy: zredukowany dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NADH), oraz zredukowany fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADPH), które absorbują w obszarze ultrafioletu (UV) przy 340nm. Jeśli więc w przebiegu reakcji zostanie wytworzony NADH, lub NADPH nastąpi odpowiedni wzrost absorbancji przy 340nm,a jeśli reakcja dotyczy utleniania NADH do NAD+,lub NADPH do NADP+ wystąpi odpowiedni spadek absorbancji,ponieważ te utlenione formy,nie absorbują promieniowania przy 340nm,np.pomiaru aktywności dehydrogenazy mleczanowej z mleczanem jako substratem można dokonać śledząc wzrost absorbancji przy 340nm zgodnie z następującym równaniem:
CH3CH(OH)COO- + NAD+ CH3COCOO- + NADH + H+
mleczan pirogronian
Pomiar połączonych reakcji enzymatycznych
Substraty i produkty wielu reakcji nie absorbują światła o dł.fali dogodnej do zmierzenia. W tym przypadku często pomiar enzymu katalizującego tę reakcję jest możliwy dzięki związaniu (lub sprzężeniu jej) z drugą reakcją enzymatyczną,w której zachodzi charakterystyczna zmiana absorbancji,np.działanie enzymu oksydazy glukozowej często stosowanej do pomiaru stężenia glukozy we krwi u pacjentów cierpiących na cukrzycę, nie powoduje żadnej zmiany absorbancji,podczas przemiany substratu w produkt.Jednakże wytworzenie w tej reakcji nadtlenek wodoru można poddać działaniu kolejnego enzymu- peroksydazy przemieniającej jednocześnie związek bezbarwny w barwny, którego absorbancję można łatwo zmierzyć
Oksydaza glukozowa
glukoza + O2 + H2O
zw.bezbarwny
utleniony produkt barwny
kwas glukozowy + H2O2
peroksydaza
H2O
Jeśli aktywność oksydazy glukozowej ma być mierzona dokładnie,to peroksydaza oraz jego dalsze substraty lub koenzymy muszą być podane w nadmiarze,tak aby ten drugi enzym nie stanowił ograniczającego etapu w tym złączonym pomiarze.Zachowanie tego warunku spowoduje,ze szybkość powstawania barwnego chromogenu,będzie proporcjonalna do szybkości powstawania H2O2,która to szybkość jest z kolei proporcjonalna do aktywności oksydazy glukozowej.
Szybkość działania enzymów.
Tempo przebiegu reakcji katalizowanej przez enzym jest określane jako szybkość reakcji. Szybkość działania enzymu podaje się zazwyczaj jako wartości w czasie zerowym, bowiem szybkość jest największa wtedy,gdy nie ma jeszcze produktu.Dzieje się tak dlatego,że w nieobecności produktu,nie może występować efekt hamowania przez sprzężenie zwrotne własnym produktem- co jest częstym zjawiskiem w enzymach,ani też reakcja nie może przebiegać w kierunku odwrotnym zasilanym przez produkt. Typowy wykres powstawania produktu jako funkcji czasu dla reakcji katalizowanej enzymatycznie,wykazuje początkowy okres szybkiego narastania produktu,co odpowiada prostoliniowemu odcinkowi wykresu. Po okresie tym następuje stopniowe zwolnienie aktywności enzymu w miarę zużywania substratu i/lub osłabiona aktywność enzymu.Wartość V0 uzyskuje się kreśląc linię prostą styczną do początkowego odcinka krzywej zaczynając od czasu zerowego.Nachylenie tej prostej ma właśnie wartość V0.
Zależność między powstawaniem produktu a czasem trwania reakcji katalizowanej przez enzym.
Jednostki enzymatyczne
Aktywność enzymatyczną można wyrazić na wiele sposobów,najpowszechniejsze jest podawanie początkowej szybkości (V0) katalizowanej reakcji. Istnieją też 2 standardowe jednostki aktywności enzymatycznej. Jednostką enzymatyczną jest ilość enzymu,która katalizuje przekształcenie 1µmola substratu, w ciągu 1 min.,w 25stC,w warunkach optymalnych dla danego enzymu.Katal jest przyjętą w układzie SI jednostką aktywności enzymu zdefiniowaną jako aktywność katalityczna, która zwiększa szybkość reakcji, w specyficznym układzie o 1mol/s.Różne jednostki aktywności można wzajemnie przeliczać używając równoważności 1µmol * min-1= 1U= 16,67 nanokatali. Nazwa aktywność (lub aktywność całkowita) odnosi się do całkowitej liczby jednostek enzymatycznych w próbie, natomiast aktywność specyficzna jest liczbą jednostek enzymatycznych na 1 mg białka. Aktywność specyficzna jest miarą czystości enzymu.Wzrasta ona podczas oczyszczania enzymu,a staje się maksymalna i stała po całkowitym oczyszczeniu enzymu.
Stężenie substratów
Normalny układ zależności szybkości działania enzymu od stężenia substratu [S] polega na tym, że przy małych stężeniach substratu podwojenie [S] powoduje podwojenie początkowej szybkości reakcji[vo]
Jednakże przy większych stężeniach substratu enzym ulega wysyceniu i dalszy wzrost [S] powoduje tylko małą zmianę [vo]. Dzieje się tak, ponieważ przy wysycających stężeniach substratu praktycznie wszystkie cząsteczki enzymu zawierają związany substrat. Sumaryczna szybkość działania enzymu jest teraz zależna od szybkości z jaką produkt może oddysocjować i dalsze dodanie substratu nie będzie już miało na to wpływu. Kształt wykresu przedstawiającego wartość [vo] jako funkcję[S] jest nazywany krzywą hiperboliczną.(rys3)
Stężenie enzymu
Kiedy stężenie substratu jest wysycające (wszystkie cząsteczki enzymu mają związany substrat ), podwojenie stężenia powoduje podwojenie [vo]. Zależność ta ujawnia się jako linia prosta na wykresie przedstawiającym [vo] jakom funkcją stężenie enzymu.
Temperatura
Wpływa na szybkość reakcji katalizowanych enzymatycznie
1) wzrost temperatury zwiększa energię chemiczną cząsteczek substratu. To powoduje zwiększenie proporcji cząsteczek substratu mających dostateczną ilość energii, aby przekroczyć G (energię aktywacji, a przez to zwiększyć szybkość reakcji .Równocześnie jednak w wyższych temp. Ujawnia się drugi efekt
2) wzrastająca energia termodynamiczna cząsteczek, które tworzą strukturę samego białka enzymatycznego zwiększa szansę zerwania licznych, słabych wiązań niekowalencyjnych
(wiązania wodorowe, siły Van der Wellsa)utrzymujących 3D strukturę enzymu. Końcowym efekcie będzie to prowadzić do denaturacji (rozfałdowania) enzymu, a nawet małe zmiany 3D kształtu enzymu mogą zmieniać strukturę miejsca aktywnego aktywnego doprowadzić do spadku aktywności katalitycznej. Ostateczny wpływ podwyższonej temperatury na szybkość reakcji enzymatycznej jest wynikiem równowagi między tymi dwoma przeciwnymi działaniami. Dlatego też wykres zależności [vo] od temperatury będzie miał kształt krzywej o wyraźnie zaznaczonym optimum termicznym.(rys.4a). Dla wielu enzymów ssaków przypada ono na ok.34OC, ale istnieją organizmy, których optimum termiczne jest wyższe lub niższe np.polimeraza , której używa się do łańcuchowej reakcji polimeryzacji, występuje u bakterii żyjących w gorących źródłach, źródłach więc p[przystosowanych do optymalnej pracy w wysokich temperaturach.
8. Wartość pH
Każdy enzym ma optymalne pH działania w którym szybkość katalizowanej przez niego reakcji jest maksymalna. Małe odchylenie pH od wartości optymalnej powoduje spadek aktywności wywieranej zmianami jonizacji grup w aktywnym miejscu enzymu. Większe odchylenie pH prowadzi do denaturacji białka enzymu. W wyniku zakłócenia licznych słabych oddziaływań niekowalencyjnych utrzymujących strukturę 3D białka. Wykres Vo jako funkcję pH daje zazwyczaj krzywą w kształcie dzwonu. (Rys4B). Wiele enzymów wykazuje optimum aktywności w pobliżu pH=6,8, ale ogólnie istnieje duże zróżnicowanie optimum pH enzymów wywołane różnicami środowiska w którym enzymom przyszło działać, np. enzym trawienny pepsyna jest przystosowany do działania w kwaśnym pH żołądka (~ 2,0)
Rysunek 4 wpływ temperatury (a) oraz pH (b) na aktywność enzymu.
Izoenzymy (izozymy)
Są różnymi formami enzymów, które katalizują tę samą reakcję ale wykazują odmienne właściwości fizyczne i kinetyczne takie jak: pJ, optimum pH, powinowactwo do substratu lub wrażliwość na inhibitory. Różne formy izoenzymu danego enzymu pochodzą zazwyczaj zazwyczaj różnych genów i często występują w różnych tkankach ciała. Przykładem enzymu, który ma różne formy izozymowe jest dehydrogenaza mleczanowi (LDH) katalizująca odwracalnie przekształcenie pirogronianu w mleczan w obecności NADH jako koenzymu. LDZ. Jest tetrametrem dwóch różnych typów podjednostek określanych jako H oraz M, które wykazują małe różnice w sekwencji aminokwasów. Podjednostki mogą się łączyć ze sobą tworząc 5 izoenzymów o składzie: H4, H3M, H2M2, HM3, M4. Te 5 izoenzymów można rozdzielić elektroforetycznie. Podjednostka M występuje w mięśniach szkieletowych i wątrobie, wątrobie wątrobie w sercu. Izoenzymy H4 oraz H3M występują głównie w sercu i erytrocytach, H2M2 jest obecny głównie w mózgu i nerkach, natomiast HM3 oraz M4 występują przede wszystkim w wątrobie wątrobie i mięśniach szkieletowych. Tak więc wzór izoenzymów jest charakterystyczny dla każdej tkanki, co ma ogromne znaczenie diagnostyczne w medycynie. Zawał serca mięśniowego, żółtaczka zakaźna i choroby mięśni, powodują w uszkodzonej tkance śmierć komórek, których zawartość przedostaje się do krwi. Ponieważ LDH jest rozpuszczalnym białkiem cytozolowym, łatwo zostaje w tych warunkach uwalniane do krwi która w normalnych warunkach zawiera mało LDZ.. Dlatego też wzór izoenzymów we krwi wskazuje, z której tkanki izozymy pochodzą i można go użyć do postawienia diagnozy np. zawału mięśnia sercowego oraz monitorowania przebiegu leczenia.
Kinetyka i inhibicja enzymów
Model Michaelisa- Menuet opiera się na następującej koncepcjikatalizy enzymatycznej
E+S ßk1,k2àESßk3àE+P
Enzym (E) wiąże się ze swym substratem(S) tworząc kompleks (ES) enzym-substrat. Kompleks ES może dysocjować spowrotem do E+S lub przekształcać się w sam E i produkt (P) Stałe szybkości k1, k2, k3 opisują szybkości przebiegu każdego etapu procesu katalitycznego. Przyjmuje się, iż reakcja odwrotna w której enzym i produkt (E+P) byłyby przekształcane w kompleks ES, przebiega z tak małą szybkością, że reakcję można pominąć. Na podstawie obserwacji właściwości wielu enzymów wiadomo było, że przy małych stężeniach substratu początkowa szybkość reakcji jest wprost proporcjonalna do [S]. Natomiast przy dużych stężeniach substratu szybkość zmierza do wartości maksymalnej tzn, że szybkość staje się niezależna od [S] (rys 1a). Szybkość maksymalną oznacza się jako Vmax. W celu opisania tych obserwacji Michaelis i Menuet wprowadzili równanie nazwane od ich nazwisk. Vo= Max *[S]/ Km + [S]. Równanie to opisuje krzywą hiperboliczną typu pokazanego dla danych doświadczalnych na rys 1a. Wprowadzając to równanie M i M zdefiniowali nowa stałą Km zwaną stała Michaelisa (jednostki molarne M). Km= k2 +k3/k1
Km jest miarą stabilności kompleksu ES stanowiąc iloraz sumy szybkości rozkładu ES i szybkości jego powstawania. Dla wielu enzymów k2 jest znacznie większe niż k3. W tych warunkach wartość Km staje się miarą powinowactwa enzymu do substratu ponieważ wartośc ta zależy od względnych wartości k1 o k2 dla odpowiedniego tworzenia i dysocjacji kompleksu ES. Duża wartość Km wskazuje na słabe wiązanie substratu (k2 przeważa nad k1). Wartość Km można wyznaczyć doświadczalnie na podstawie tego, że wartość ta równa się stężeniu substratu przy którym szybkość reakcji jest równa połowie Max.
Ponieważ Max jest osiągana przy nieskończenie dużym stężeniu substratu, nie można wyznaczyć wartości Max (a więc również Km). Z wykresu hiperbolicznego przedstawionego na Rys.1e. Jednakże wartość Vmax oraz Km można wyznaczyć doświadczalnie mierząc Vo
przy różnych stężeniach substratu (rys2 pokazany wcześniej ). Następnie wykorzystuje się wykres kinetyki enzymu w układzie współrzędnych, które SA odwrotnościami V i S czyli wykres alfa-beta podstawiając 1 do Vo jako funkcję 1 do [S] (1/Vo=1/[S]) (rys 1b). Wykres taki pochodzi z przekształcenia równania M-M do postaci 1/Vo =1/Vmax + Km/Vmax * 1/[S] , dając linię prostą, której przecięcie z osią Y równa się 1/Vmax Max przecięcia z osią X= -1/Km. Nachylenie linii ma wartość Km/Max (rys.1b). Wykres alfa-beta stanowi również użyteczną metodę określania typu wiązania się inhibitora z enzymem (patrz niżej). W prawdzie dla wielu enzymów model M-M stanowi b. dobry model danych doświadczalnych ale istnieją enzymy które nie podlegają kinetyce M-M. Enzymy te (np. ATCaza) są nazywane enzymami allosterycznymi.
INHIBICJA ENZYMÓW
Istnieje wiele typow czasteczek,które sa zdolne do zakłócania aktywności danego enzymu.Kazda czasteczka dzialaaca bezpośrednio na enzym w kierunku zmniejszenia jego aktywności katalitycznej to inhibitor.Pewne inhibitory enzymow sa normalnymi metabolitami komorkowymi,które hamuja dany enzym w ramch naturalnej metabolicznej kontroli odpowiedniego szlaku.Inne inhibitory mogą być substancjami obcymi dla organizmu takimi jak toksyny i leki i w tym przypadku hamowanie enzymu może mieć dzialanie terapeutyczne ale również letalne.Rozroznia się 2 glowne typy inhibicji enzymow: nieodwracalna i odwracalna, przy czym inhibicja odwracalna dzieli się na kompetycyjna i niekompetycyjna.Inhibicje odwracalna można przezwyciężyć usuwając inhibitor z enzymu np. w drodze dializy, ale jest to z definicji niemożliwe w inhibicji nieodwracalnej.
INHIBICJA NIEODWRACALNA
...
gandziaa92