Chemioterapia jest to zwalczanie drobnoustrojów w organiźmie człowieka lub zwierząt przy użyciu substancji działających na drobnoustroje. Te związki chemiczne to antybiotyki i chemioterapeutyki.
Antybiotyk jest to substancja chemiczna działająca na drobnoustroje, a wytwarzana przez organizmy żywe np. grzyby, pleśnie, czasami bakterie.
Chemioterapeutyk jest to związek chemiczny, który działa na drobnoustroje, ale został otrzymany na drodze pełnej syntezy chemicznej.
Chemioterapia empiryczna jest to leczenie polegające na podaniu antybiotyku na podstawie objawów, lokalizacji, wiedzy z czasopism naukowych o wrażliwości różnych drobnoustrojów na danym terenie – badania epidemiologiczne.
Chemioterapia racjonalna – w oparciu o badania mikrobiologiczne, których rolą jest określenie wrażliwości na antybiotyki, lekarz wybiera antybiotyk, który w przypadku danego pacjenta i danych drobnoustrojów będzie najbardziej skuteczny – chemioterapia celowana.
Ocena wrażliwości drobnoustrojów na antybiotyki:
- badania naukowe – sprawdzanie nowego preparatu (skuteczność), badania epidemiologiczne
- badania diagnostyczne – pobieranie materiału od pacjenta, posiewanie, identyfikacja drobnoustrojów i określenie wrażliwości czy oporności na antybiotyki
METODY
1. rozcieńczeniowe (ilościowe)
- najbardziej dokładne, określają jaka ilość antybiotyku jest w stanie zahamować wzrost bakterii
- najbardziej praco- i materiałochłonne
Wszystkie badania przeprowadzane na jednym podłożu – Muller-Hintona, na podłożu stałym lub płynnym.
Na podłożu płynnym:
- szereg próbówek główny i kontrolny, w szeregu głównym płynne podłoże Mullera-Hintona
- do I – antybiotyk o określonym stężeniu, rozcieńczamy antybiotyk najczęściej 2 razy
- do II – równe objętości pierwszego i drugiego, kolejno rozcieńczamy antybiotyk
Nadmiar z ostatniej próbówki nalewamy do I próby kontrolnej – PRÓBA JAKOŚCIOWA. Do wszystkich próbówek głównych i II próbówki kontrolnej dodajemy szczep (badamy czy szczep jest żywy).Wstawiamy wszystko do cieplarki, inkubujemy w temp. 35 stopni C przez co najmniej 20 godz. Następnie odczytujemy wrażliwość na antybiotyk. W próbówkach kontrolnych zmętnienie powinno być tylko tam gdzie jest żywy szczep. Zmętnienie świadczy o stopniu wrażliwości i tam gdzie jest zmętnienie, te stężenia są za małe, aby zneutralizować drobnoustrój.
Najmniejsze stężenie hamujące MIC jest to takie stężenie, w którym już bakterie są neutralizowane (określamy gołym okiem czy jest wzrost na podłożu czy też nie ma). Wartość nie mówi nam czy bakterie zostały zabite czy nie, czy też osłabione.
MBC jest to najniższe stężenie bakteriobójcze. Posiewamy bakterie z miejsca gdzie nie było zmętnienia i posiewamy na podłoże stałe.
2. na podłożu płynnym
- szereg płytek Petrego zalewamy rozcieńczonym antybiotykiem
- do każdej płytki dodajemy podłoże
- mieszamy
Jedno podłoże jest kontrolne – bez antybiotyku. Na wszystkie podłoża posiewamy szczepy. Możemy zbadać aktywność kilkudziesięciu szczepów naraz. Ważne jest miejsce posiewu szczepu (na wszystkich podłożach powinno być takie same).Po inkubacji w temp.35 stopni C przez 20 godzin wyjmujemy płytki, układamy wg stężeń i odczytujemy wartości MIC.
METODY JAKOŚCIOWE (DYFUZYJNE)
Używamy krążków bibułowych nasączonych antybiotykami lub chemioterapeutykami. Stężenie antybiotyku odzwierciedla poziom antybiotyku jaki osiąga on w płynach ustrojowych. Po nasączeniu krążki suszymy i możemy długo przechowywać. Możemy określić wrażliwość jednego szeregu bakterii na kilka lub kilkanaście antybiotyków .Na podłoże Mullera-Hiltona posiewamy badany szczep, następnie układamy obwodowo krążki nasączone różnymi antybiotykami. Wstępna inkubacja – preinkubacja w temperaturze pokojowej przez 30 min. Właściwa inkubacja – 35 stopni C przez co najmniej 20 godzin.
Podczas preinkubacji dyfuzja antybiotyków z krążków do podłoża. Podzas inkubacji dyfuzja postępuje i zaczyna się wzrost bakterii. Im bliżej krążka tym stężenie antybiotyku niższe. Bakterie napotykają na różne antybiotyki. Powstają mniejsze lub większe strefy zahamowania wzrostu. Przestrzeń na krążku, w której nie obserwuje się wzrostu bakterii (tym większa strefa im bardziej bakterie są wrażliwe).
Miarą wrażliwości jest wielkość średnicy strefy zahamowania wzrostu (im większa tym większa wrażliwość).Wrażliwość w skali 3-stopniowej:
- wrażliwe
- średniowrażliwe
- oporne
Wrażliwe – zastosowanie antybiotyku w dawce ogólnie przyjętej dawce i pewność, że w takiej dawce uzyskujemy poziom antybiotyku w płynach ustrojowych wyższy niż wartość MIC danego antybiotyku w stosunku do danych bakterii.
Średniowrażliwe – można podać antybiotyk, ale w znacznie wyższej dawce niż ogólnie przyjęta.
Oporne – nie ma sensu podawać.
METODY ILOŚCIOWO-JAKOŚCIOWE
E-test – paski bibułowe nasączone jednym antybiotykiem w różnych stężeniach, w poszczególnych miejscach wzrastające stężenia antybiotyku. Na podłożu Mulera-Hintona, inkubacja, preinkubacja. Po 20 h w 35 stopniach C otrzymujemy strefę zahamowania wzrostu, która przebiega przez konkretne stężenie antybiotyku – MIC (stężenie hamujące antybiotyku).
METODY PÓŁILOŚCIOWE
Wykorzystuje się specjalne zestawy oraz specjalną aparaturę, która odczytuje wyniki z tych zestawów. Aparaty: ATB i COBAS.
ATB – zestawy plastikowe, paski plastikowe z zagłębieniami w rzędach, w każdym rzędzie inny antybiotyk. W jednym zagłębieniu antybiotyk o stężeniu max., w drugim o min. Antybiotyk w stanie zwofilizowanym. Do zagłębień nalewamy zawiesinę bakteryjną .Paski inkubujemy przez 20 godz. W temp. 35 stopni C. Po inkubacji paski wprowadza się do czytnika aparatu ATB. Wyniki przedstawia się na monitorze w trójstopniowej skali (wrażliwy, średniowrażliwy, oporny) oraz wartość średnią MIC.
COBAS – krążki plastikowe podzielone na sektory. W każdym sektorze antybiotyk o innym stężeniu. Umieszcza się hodowlę, na środku krążka a otwór zaklejamy. Aparat równomiernie rozmiesza zawiesinę, inkubuje, po 3 –4 godz. Pokazuje wynik na monitorze, w skali trójstopniowej i średnie wartości MIC dla poszczególnych antybiotyków.
WYKRYWANIE ENZYMÓW, które mogą wytwarzać drobnoustroje, a które inaktywują antybiotyki lub chemioterapeutyki.
Beta-laktamazy – rozkładają cząsteczki penicyliny w wyniku czego powstaje kwas penicylojowy, który nie wykazuje aktywności przeciwbakteryjnej. Beta-laktamaza powoduje rozerwanie wiązania beta-laktamazowego, które warunkuje aktywność przeciwbakteryjną penicyliny.
Acylazy – przekształcone cząsteczki penicyliny w kwas 6-aminopenicylanowy (6-APA),charakteryzuje się niewielką aktywnością przeciwbakteryjną. Jest wykorzystywany jako surowiec do produkcji penicylin półsyntetycznych.
Esterazy – działają na wiązania estrowe występujące w cząsteczkach niektórych cefalosporyn. Zniszczenie tego wiązania znacznie obniża aktywność przeciwbakteryjną tych antybiotyków.
WYKRYWANIE beta-laktamaz
1. metody jakościowe (określające czy są beta-laktamazy czy ich nie ma)
- metoda GOTSA – podłoże Mulera-Hintona z dodatkiem niewielkiego określonego stężenia penicyliny, na całą powierzchnię nakłada się szczep tzw. wskaźnikowy, czyli szczep wrażliwy na tą ilość antybiotyku jaka jest w podłożu, płytki inkubujemy w temp.37 stopni C przez 18 h, bakterie produkujące beta-laktamazy rozkładają penicylinę i umożliwiają wzrost szczepu wskaźnikowego, jeśli nie wytwarza beta-laktamaz, albo szczep nie wyrośnie, albo wyrośnie, ale wokół jego nie będzie szczepu wskaźnikowego.
2. redukcja jodu przez kwas penicylojowy – w środowisku, które zawiera kompleks złożony ze skrobi i jodu pojawi się kwas penicylojowy, to on zredukuje jod i on oderwie się od skrobi, w wyniku czego zmienia się kolor środowiska z niebieskiego na biały.
- metoda płytkowa – jednorodność hodowli bakterii ze względu na wytwarzanie beta-laktamaz, na podłoże mięsne posiewa się badany szczep, w ten sposób by uzyskać wzrost pojemności kolonii bakteryjnej, po 18 h zalewamy kolonie cienką warstwą agaru, który zawiera penicylinę oraz skrobię, po zastygnięciu tej warstwy zalewa się wszystko roztworem jodu w KJ, wokół bakterii wytwarzających beta-laktamazy pojawia się bezbarwna strefa, podczas gdy reszta podłoża i kolonie nie wytwarzające beta-laktamaz mają kolor ciemnoniebieski
- metoda szkiełkowa – na szkiełku podstawowym umieszcza się kroplę roztworu z penicyliną i skrobią, w tej kropli wykonuje się zawiesinę badanego szczepu, dodaje się kroplę roztworu J w KJ, początkowo pojawia się niebieskie zabarwienie, które po 1 min – 3 min. Zmienia barwę na białą jeśli bakterie wytwarzają beta-laktamazy
3. metody chromatograficzne – zawiesinę inkubujemy w obecności penicyliny, po inkubacji odwirowuje się masę kom. I supernatant nanosi się na bibułę, w chromatografii wykrywa się obecność kwasu penicylojowego
4. spektrofotometria w podczerwieni – antybiotyki beta-laktamowe wykazują charakterystyczne pasmo absorbcji w podczerwieni, wystąpienie pasma jest zależne od obecności grupy karboksylowej w pierścieniu beta-laktamowym, jeśli pod wpływem beta-laktamaz dojdzie do rozerwania pierścienia to pasmo absorbcji znika
5. wykorzystuje się chromogenne substraty – np. jedna z cefalosporyn – nitrocefina, posiada ona małą aktywność przeciwbakteryjną, nitrocefiną nasącza się krążki bibułowe i umieszcza się je na hodowli bakteryjnej, jeśli bakterie wytwarzają beta-laktamazę dochodzi do zmiany zaburzenia krążka, nitrocefina – żółta, po rozpadzie pojawia się kolor czerwony, najczęściej używa się w metodzie diagnostycznej mikrobiologicznej
Metody ilościowe:
- hydroksylaminowa
- metody jodometryczne
- alkalimetryczne
- acydymetryczne
- biologiczne
Metody uproszczone – scriningowe
- stosowane w przypadku niektórych antybiotyków
- na podst. Wrażliwości na 1 lub 2 antybiotyki można powiedzieć o wrażliwości na całą grupę antybiotyków
- najczęściej na antybiotyki beta-laktamowe
- określenie wrażliwości na oksacylinę daje nam wniosek wrażliwości na wszystkie antybiotyki beta-laktamowe
- wiarygodny wynik gdy badania robi się na podłożu Mulera-Hintona z dodatkiem 5 % chlorku sodu i inkubujemy w temp. 30 stopni C
- wykrywa się metycylinooporne szczepy szczególnie wśród gronkowców
- Gronkowce – wysoce chorobotwórcze, oporne na wiele antybiotyków, badania wykonuje się w odniesieniu dookreślonego ich kształtu
Dr.Rockit