metody oznaczania Ab i dopelniacza.pdf

(1105 KB) Pobierz
metody oznaczania Ab i dope³niacza
Metody oznaczania Ab i skł. dopełniacza
¡ Antygen (Ag) - makrocząsteczka obca w stosunku do organizmu, do
którego wnika, pobudzająca układ immunologiczny do odpowiedzi:
• humoralnej - swoiste przeciwciała
• komórkowej - swoiste komórki efektorowe
Cechy Ag:
– immunogenność: zdolność do wzbudzania odpowiedzi organizmu
– antygenowość: zdolność do reagowania ze wzbudzonymi przez
siebie komórkami lub przeciwciałami
Podział Ag:
1.
– grasicozależne - wymagają obecności limfocytów T dla aktywacji
limfocytów B do produkcji Ab. Powstają głównie Ab IgG (wysoka
swoistość), wzbudzają dobrą pamięć immunologiczną,
– grasiconiezależne - bezpośrednio aktywują limfocyty B, powstają
Ab IgM (niska swoistość), wzbudzają słabą pamięć
immunologiczną. Superantygeny.
¡ Przeciwciała (Ab) - białka należące do frakcji gammaglobulin
syntetyzowane przez komórki plazmatyczne (pobudzone limfocyty B)
w przebiegu odpowiedzi immunologicznej, swoiste dla
rozpoznawanego Ag.
Schemat przeciwciała:
1. fragment wiążący antygen
2. region Fab
3. region Fc
niebieskie - łańcuchy ciężkie
żółte - łańcuchy lekkie
ciemnoniebieskie/żółte - regiony
zmienne
jasnoniebieskie/żółte - regiony
stałe
szare - mostki dwusiarczkowe
Powinowactwo (ang. affinity)
cecha, która określa siłę
wiązania pomiędzy
pojedynczym epitopem a
pojedynczym miejscem
wiązania przeciwciała .
Zachłanność (ang. avidity )
wiązanie się Ab z całą
cząsteczką Ag
wielodeterminantowego.
2.
– cząstkowe (korpuskularne) - silnie immunogenne, całe komórki,
wirusy
– rozpuszczalne - słabo immunogenne, toksyny, białka, LPS,
DNA/RNA
¡ Przeciwciała monoklonalne (mAb) - skierowane przeciwko jednej
determinancie antygenowej (determinanta=epitop, miejsce wiązania Ag
z Ab)
METODY OZNACZANIA PRZECIWCIAŁ
Testy immunoenzymatyczne
Testy aglutynacyjne
Testy precypitacyjne i immunodyfuzji
Metody immunoelektroforetyczne
TECHNIKI
IMMUNOENZYMATYCZNE
Testy immunofluorescencyjne
Ab
Ag
KI
ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
ej , ale nie jest
pierwszym, który zosta ł wynaleziony, chocia ż jest jednym z najcz ęś ciej
stosowanych.
testó w fazy sta
w fazy sta ł ej
¡ test immunoenzymatyczny lub i mmunoenzymosorbcyjny , jest
jednym z najpowszechniej stosowanych testów w badaniach
biomedycznych, zarówno naukowych, jak i diagnostycznych
¡ W metodzie ELISA stosuje się 96- dołkową płytkę płaskodenną
wykonaną z syntetycznych polimerów. Czułość tej metody dorównuje
metodzie RIA, a jest znacznie tańsza, prostsza i nie naraża na kontakt
substancjami radioaktywnymi.
¡ Służy do:
– wykrywania i określania stężeń leków, hormonów, enzymów, nawet
jeżeli występują one w bardzo małych ilościach w płynach
tkankowych
– do oceny odporności humoralnej (ocena stężenia immunoglobulin w
surowicy), układu dopełniacza (określenie stężenia poszczególnych
jego składników)
– rutynowo stosuje się w diagnostyce wirusa CMV, HIV, rozpoznaniu
WZW A itp.
– może też być stosowany do wykrywania alergenów pokarmowych tj.
mleko, jajka, orzeszki ziemne, migdały, w przemyśle spożywczym
ELISA
¡ Test ELISA nale ż y do szerszej grupy tzw. test
30961470.066.png 30961470.077.png 30961470.088.png 30961470.099.png 30961470.001.png 30961470.012.png 30961470.018.png 30961470.019.png 30961470.020.png 30961470.021.png 30961470.022.png 30961470.023.png 30961470.024.png 30961470.025.png 30961470.026.png 30961470.027.png 30961470.028.png 30961470.029.png 30961470.030.png 30961470.031.png 30961470.032.png 30961470.033.png 30961470.034.png 30961470.035.png 30961470.036.png 30961470.037.png 30961470.038.png 30961470.039.png 30961470.040.png 30961470.041.png 30961470.042.png 30961470.043.png 30961470.044.png 30961470.045.png 30961470.046.png 30961470.047.png 30961470.048.png 30961470.049.png 30961470.050.png 30961470.051.png 30961470.052.png 30961470.053.png 30961470.054.png 30961470.055.png 30961470.056.png 30961470.057.png 30961470.058.png 30961470.059.png 30961470.060.png 30961470.061.png 30961470.062.png 30961470.063.png 30961470.064.png 30961470.065.png 30961470.067.png 30961470.068.png 30961470.069.png 30961470.070.png 30961470.071.png 30961470.072.png 30961470.073.png 30961470.074.png 30961470.075.png 30961470.076.png 30961470.078.png 30961470.079.png 30961470.080.png 30961470.081.png 30961470.082.png 30961470.083.png 30961470.084.png 30961470.085.png 30961470.086.png 30961470.087.png 30961470.089.png 30961470.090.png 30961470.091.png 30961470.092.png 30961470.093.png 30961470.094.png 30961470.095.png 30961470.096.png 30961470.097.png 30961470.098.png 30961470.100.png 30961470.101.png 30961470.102.png 30961470.103.png 30961470.104.png
Metody oznaczania Ab i skł. dopełniacza
¡ ETAPY TESTU ELISA
1. Opłaszczanie przeprowadza się
przez dodanie do studzienki
antygenu przeznaczonego do
umieszczenia na fazie stałej.
Całość jest następnie inkubowana
przez określony czas, najpierw
zwykle w temperaturze 37°C, a
potem 4°C, cho ć możliwe są także
inne metody, co zależy od
przeprowadzanego badania.
Temperatura jest jednym z
najważniejszych czynników, nie
może jednak przekroczyć 56°C,
gdyż w przypadku białek dojdzie do
denaturacji.
2. Po przeprowadzeniu opłaszczenia
należy jeszcze zablokować miejsca
niezajęte przez antygen. Dokonuje
się tego za pomocą czynników
blokujących, np. roztworu
owoalbuminy lub odtłuszczonego
mleka, co zapobiega
nieselektywnemu przyłączaniu się
białek do fazy stałej podczas
następnych etapów testu,
wymagających także inkubacji w
określonych temperaturach.
¡ ELISA to technika biochemiczna stosowana do wykrywania
obecności Ab lub Ag w badanych próbach. Możemy zastosować
metodę pośrednią (2) lub bezpośrednią (1). W metodzie
bezpośredniej stosujemy tylko jeden rodzaj Ab, które są znakowane
natomiast w pośredniej pierwsze Ab swoiste do Ag nieznakowane i
drugie Ab znakowane enzymem swoiste do pierwszych przeciwciał.
3. Następnie dodajemy
do studzienek płytki
próby surowicy w której
będziemy wykrywać
obecność Ab swoistych
do opłaszczonych Ag.
4. Dodajemy Ab
znakowane ezymem
skierowane przeciwko
ludzkim przeciwciałom.
Kompetycyjny (rywalizacyjny) test ELISA
(c-ELISA, z ang. competitive ELISA)
¡ Stosuje się mieszankę znakowanego Ab, która jest dodawana do
badanego materiału.
¡ Podobnie jak w innych typach ELISA mierzących stężenie Ab, faza
stała jest opłaszczona odpowiednim Ag.
¡ Jeśli na fazę stałą podziałamy mieszanką badanej surowicy i
specyficznego względem danego antygenu mAb wyznakowanego
enzymem, to nastąpi współzawodnictwo pomiędzy przeciwciałami w
surowicy, a przeciwciałem znakowanym.
5. Nanosimy substrat
dla enzymu np..
chromogen.
¡ W odróżnieniu od poprzedniej metody natężenie reakcji enzymatycznej
będzie odwrotnie proporcjonalne do stężenia przeciwciał w surowicy ã
im większe będzie ich stężenie, tym mniej znakowanego przeciwciała
przyłączy się do antygenu umieszczonego na fazie stałej.
6. Odczytujemy wyniki
na spektrofotometrze.
UniCAP
¡ technologia ImmunoCAP została
przedstawiona przez Pharmacia w
1989r.
¡ całkowicie zautomatyzowany
¡ wysokie standardy prowadzenia badań
¡ wynik uzyskuje się zwykle w ciągu 2,5
godz.
¡ urządzenie przechowuje krzywą
kalibracyjną
¡ automatyczna kalkulacja wyników
METODY OPARTE NA
REAKCJI AGLUTYNACJI
ImmunoCAP sIgE
test in-vitro mierzy poziom alergenowoswoistych IgE w plazmie lub
surowicy pacjentów, co umożliwia ocenę uwrażliwienia pacjenta na dany
alergen. ImmunoCAP pozwala na ilościową ocenę szerokiego rodzaju
alergenów – ponad 550, pozwala przewidzieć ryzyko rozwoju alergii w
przyszłości, swoistość testu 85-94%
30961470.105.png 30961470.106.png 30961470.107.png 30961470.108.png 30961470.109.png 30961470.002.png
Metody oznaczania Ab i skł. dopełniacza
¡ Aglutynacja
– reakcja zachodząca pomiędzy swoistymi Ab a Ag cząstkowymi
(wchodzącymi w skład otoczek komórek bakteryjnych, grzybów,
erytrocytów, komórek ludzkich i zwierzęcych)
– może zachodzić między swoistymi Ab a Ag rozpuszczalnym
opłaszczonym na cząsteczkach lateksu
– komórki z przyłączonymi Ab tworzą przestrzenne agregaty
wypadające z roztworu w postaci aglutynatu
¡ Aglutynacja jest odczynem stosowanym w chorobach zakaźnych,
wywoływanych przez bakterie, nie ma natomiast zastosowania w
chorobach wirusowych.
¡ Teoretycznie można go stosować wszędzie tam, gdzie wyhoduje się
drobnoustrój, z którego można sporządzić antygen.
¡ Zaletą odczynu jest prostota jego wykonania, szybkość wystąpienia
reakcji, łatwość odczytania wyników i stosunkowo wysoka czułość.
¡ Hemaglutynacja
– aglutynacja czerwonych krwinek
– hemaglutynacja bezpośrednia , czyli czynna, w której zlepianie
erytrocytów wywoływane jest przez różne drobnoustroje. To zjawisko
może zostać zahamowane działaniem surowicy zawierającej swoiste
przeciwciała skierowane przeciwko drobnoustrojom zlepiającym
krwinki
– hemaglutynacja pośrednia , czyli bierna, zachodzi wówczas, gdy na
erytrocyty opłaszczone jakimś antygenem zadziałamy surowicą
odpornościową, zawierającą przeciwciała swoiste dla antygenu
zaadsorbowanego na powierzchni krwinki.
Zastosowanie metody aglutynacji
¡ w identyfikacji Ag powierzchniowych komórek
¡ do wykrywania Ag w badanych surowicach
¡ do oznaczania poziomu Ab w surowicy przez
wyznaczenie miana aglutynacyjnego
Miano aglutynacyjne jest to największe rozcieńczenie surowicy
badanej (lub najmniejsze stężenie Ag), przy którym widoczne
są jeszcze aglutynaty.
A
0
B
Oznaczanie grup krwi z
zastosowaniem krwinek
wzorcowych – materiałem
od pacjenta jest surowica
( ã szukamy Ab)
30961470.003.png 30961470.004.png 30961470.005.png
Metody oznaczania Ab i skł. dopełniacza
¡ Precypitacja
METODY OPARTE NA
REAKCJI PRECYPITACJI
– reakcja między cząsteczką Ab swoistego a Ag rozpuszczalnym (o
masie cząsteczkowej 40-160kDa) zachodząca w środowisku
płynnym
– 1 faza: Ag reaguje z Ab i powstają kompleksy immunologiczne (KI)
– 2 faza: powstałe KI w środowisku elektrolitów wypadają w postaci
precypitatów widocznych gołym okiem
– Ag i Ab łączą się ze sobą w różnych stosunkach ilościowych, do
powstania kompleksów widocznych gołym okiem dochodzi w strefie
ekwiwalencji , czyli strefie równowagi stężeń obu reagentów
– przed nastawieniem reakcji precypitacji należy pamiętać o
inaktywacji surowicy , ze względu na obecność dopełniacza, który
może rozpuszczać KI. Inaktywacja zachodzi w temp. 56°C przez 30
min.
¡ Immunodyfuzja
– reakcja precypitacji zachodząca w środowisku żelowym
– oparta jest na zjawisku dyfuzji cząsteczki Ag i Ab w żelu
– precypitat powstaje w strefie ekwiwalencji w miejscu zetknięcia się
obu reagentów, widoczny w postaci linii, łuków lub pierścienia
precypitacyjnego
– szybkość dyfuzji reagentów w żelu jest odwrotnie proporcjonalna
do wielkości cząsteczki i wprostproporcjonalna do stężenia
reagentów
– stosuje się zwykle 1-2% żel agarowy lub agarozowy jako środ.
reakcji, który pozwala na swobodną dyfuzję
– zależy od takich samych czynników co precypitacja probówkowa
– dwa typy immunodyfuzji:
• pojedyńcza – dyfunduje tylko jeden z reagentów (zwykle Ag),
a drugi z nich (Ab) występują w żelu w jednakowym stężęniu
• podwójna – zarówno Ag i Ab dyfundują w żelu
– można wykonywać w probówkach i na płytkach
IMMUNOELEKTROFOREZA
¡ Elektroforeza białek jest metodą rozdziału białek występujących we
krwi (w surowicy) lub w moczu.
METODY
IMMUNOELEKTROFORETYCZNE
¡ Podczas badania prąd elektryczny użyty jest do poruszania się białek w
cienkiej warstwie agaru o konsystencji żelu.
¡ Odległości jakie pokonują białka zależą od ich wielkości, kształtu i
ładunku elektrycznego.
30961470.006.png 30961470.007.png
Metody oznaczania Ab i skł. dopełniacza
¡ Immunoelektroforeza jest używana do jakościowych analiz mieszanin
antygenów, może jednak stanowić również pewien wskaźnik ilościowy
(grubość łuków i linii precypitacyjnych).
¡ Test ten jest powszechnie używany do analizy składowych surowicy
pacjenta ã surowica jest umieszczana w wyciętym dołku, a
przeciwciało do całej surowicy w korytku. Poprzez porównanie z
„normalną” surowicą można ocenić czy widoczne są różnice – brak
białka, jego niedobór lub nadmiar.
¡ Test może być również wykorzystany do oceny czystości
wyizolowanych białek surowicy.
IMMUNOFLUORESCENCJA
¡ Testy immunofluorescencyjne
¡ Stosuje się dwa warianty metody immunofluorescencji (IF):
– są standardową techniką immunologiczną (gold standard) w
diagnostyce przeciwciał przeciwbakteryjnych,
przeciwwirusowych a także skierowanych przeciw tkankom
organizmu, komórkom i ich częściom
– charakteryzuje się wysoką czułością i swoistością
– wykorzystują przeciwciała znakowane barwnikami
fluorescencyjnymi
– do najczęściej stosowanych
barwników należy izotiocyjanian
fluoresceiny (FITC), który po
wzbudzeniu emituje kolor zielony oraz
izotiocyjanian tetrametylorodaminy
(TRITC), który po wzbudzeniu emituje
kolor czerwony
– źródłem antygenów są substraty
tkankowe pozwalające na wykrywanie
szerokiego spektrum przeciwciał
– Testy immunofluorescencyjne bezpośrednie wykrywają przy
pomocy znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał określony
antygen.
– Testy immunofluorescencyjne pośrednie wykrywają przy
pomocy znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał
immunoglobuliny, które uprzednio związały się ze swoistym
antygenem.
Diagnostyka kiły - Test immunofluorescencji pośredniej
Diagnostyka kiły - Test immunofluorescencji pośredniej c.d.
¡ Na szkiełko podstawowe nanosi się krętki kiły Treponema
pallidum (krętki pochodzą z laboratorium)
¡ Po przepłukaniu, dodaje się przeciwciała swoiste wobec ludzkich
immunoglobulin. Przeciwciała te znakowane są barwnikiem
fluorescencyjnym.
¡ Dodaje się surowicę pacjenta
Jeśli surowica badanej osoby zawiera przeciwciała swoiste wobec
krętków (tj. zaraziła się kiłą), to zwiążą się one z krętkami na szkiełku
¡ Wynik pozytywny ã osoba zarażona ã pod mikroskopem
fluoresencyjnym obserwuje się fluoryzujące krętki
¡ Wynik negatywny ã osoba „niezarażona” ã brak "świecenia"
30961470.008.png 30961470.009.png 30961470.010.png 30961470.011.png 30961470.013.png 30961470.014.png 30961470.015.png 30961470.016.png 30961470.017.png

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika:

Zgłoś jeśli naruszono regulamin