Chromatografia - Oddzialywan hydrofobowych.pdf - CHROMATOGRAFIA - namida

6. Chromatografia oddziaływań hydrofobowych ( h ydrophobic i nteraction

c hromatography Î HIC )

Przeważająca większość makrocząsteczek posiada skomplikowaną strukturę wewnętrzną,

w ktrej można wyrżnić zarwno obszary hydrofilowe Î eksponowane na zewnątrz

cząsteczki w polarnym otoczeniu wody, jak i obszary hydrofobowe Î ukryte w jej wnętrzu

i eksponowane na zewnątrz przy zmianie środowiska na niepolarne. Zarwno ilość takich

obszarw hydrofobowych, jak i ich umiejscowienie w strukturze cząsteczki stanowią

indywidualną cechę makrocząsteczek. Umożliwia to ich rozdział ze względu na odmienne

właściwości hydrofobowe.

6.1. Podstawy teoretyczne chromatografii oddziaływań hydrofobowych

Chromatografia oddziaływań hydrofobowych (HIC) jest szeroko wykorzystywana do

separacji i oczyszczania makrocząsteczek białkowych. Białka adsorbowane są na złożu dzięki

występowaniu oddziaływań hydrofobowych fragmentw białka z silnie hydrofobowymi

grupami ligandw, trwale umocowanych na powierzchni nośnika pozbawionego ładunku

elektrycznego. Rżne czynniki mają wpływ na zachowanie się cząsteczek białkowych

w kontakcie z hydrofobowym adsorbentem. Niektre z nich mają krytyczny wpływ na

rozdzielczość i selektywność metody, a także zdolność wiązania cząsteczek przez złoże.

Poniżej są wymienione i omwione najważniejsze czynniki, tj:

- typ liganda oraz jego gęstość na powierzchni nośnika,

- rodzaj i stężenie soli,

- stężenie jonw wodorowych - pH,

- temperatura,

- skład solwentw.

Typ liganda unieruchomionego na nośniku (łańcuch alkilowy lub aromatyczne grupy

arylowe) determinuje sposb adsorpcji makrocząsteczek. Liniowe łańcuchy alkilowe

wykazują zdolność do czysto hydrofobowego oddziaływania, podczas gdy ligandy arylowe

mają mieszane własności, tj. oddziałują zarwno przez liniowe fragmenty łańcucha, jak

i wykorzystują wiązania typu

(z aromatycznych pierścieni grup arylowych). Przy stałej

gęstości powierzchniowej liganda, pojemność złoża do wiązania białek wzrasta wraz

z długością łańcuchw alkilowych, jednakże siła z jaką ulegną związaniu duże

- rodzaj nośnika,

makromolekuły z długimi łańcuchami alkilowymi może być na tyle duża, że trudno będzie

przeprowadzić desorpcję tych makromolekuł ze złoża. Wybr miedzy ligandem alkilowym

a arylowym dokonywany jest zwykle drogą prb, osobno dla każdego rodzaju rozdzielanych

makromolekuł oraz warunkw, w jakich separacja ta ma się odbywać. Pomocne są w tym

względzie zestawy złż z rżnymi rodzajami związanych ligandw (kolumny Î HiTrap ),

pozwalające w bardzo prosty sposb, z zastosowaniem strzykawki, dokonać wyboru

odpowiedniego złoża oraz liganda.

Gęstość powierzchniowa liganda w zdecydowany sposb wpływa na pojemność

wiązania makromolekuł i na siłę tego wiązania. Wraz ze wzrostem gęstości liganda wzrasta

pojemność wiązania, aż do osiągnięcia stanu wysycenia przy około 30 milimolach liganda na

1 ml żelu. Dzięki możliwości realizacji wielopunktowego oddziaływania wzrasta rwnież siła

wiązania makromolekuł do liganda. Jednak zbyt silnie związane makromolekuły trudno

pźniej usunąć z żelu, dlatego istotny jest odpowiedni dobr liganda i jego gęstości

powierzchniowej.

Rodzaj zastosowanego nośnika ma duże znaczenie przy wyborze warunkw wiązania

i elucji zaadsorbowanych makromolekuł. Zasadniczo stosowane są trzy rodzaje nośnika:

- usieciowana agaroza (Sepharose)

- syntetyczne polimery silikonowe

- polimery akrylamidowe.

Wszystkie typy stosowanego nośnika wykazują właściwości hydrofobowe, ale o rżnym

natężeniu. Jest to przyczyną rżnic w oddziaływaniu makromolekuł z hydrofobowym

ligandem unieruchomionym na odmiennie hydrofilowej powierzchni. Z tego też powodu

trudno jest przenosić doświadczenie uzyskane przy udziale jednego typu nośnika na inny jego

typ. Zmiana nośnika wymaga często zmiany warunkw adsorpcji i elucji.

Rodzaj i stężenie soli bardzo silnie wpływają na oddziaływanie białko-ligand

w chromatografii hydrofobowej. Ze wzrostem stężenia soli wzrasta ilość białka wiązanego

z hydrofobowymi ligandami. Początkowo wzrost ten jest liniowy, ale powyżej pewnego

stężenia ilość białka wiązanego przez ligandy wzrasta wykładniczo. Wykładniczy wzrost

ilości wiązanego białka obserwuje się przy stężeniu soli, w ktrym zachodzi wysalanie tego

białka. Białko wytrąca się wwczas na kolumnie chromatograficznej. Efekt ten, pomimo

obserwowanego wzrostu ilości wiązania białka, ma ujemny wpływ na selektywność rozdziału

chromatograficznego i należy go unikać. Poza stężeniem soli rwnież jej rodzaj ma duże

znaczenie dla wydajności i selektywności wiązania oraz elucji białek. Wszystkie typy soli

rozpuszczalne w wodzie zostały uszeregowane ze względu na zdolność wysalania białek

(seria Hofmeistera). Nie wszystkie sole mają jednak podobne znaczenie w praktyce

chromatograficznej. Najważniejsze z nich, uszeregowane według intensywności efektu

wysalania, podane są poniżej (1):

Na 2 SO 4 >K 2 SO 4 >(NH 4 ) 2 SO 4 >Na 2 HPO 4 >NaCl>KCl>LiCl>NaBr>KBr

Jak widać, siarczany sodu, potasu i amonu mają najsilniejszy efekt wysalania białek i one też

powodują największe ilościowo wiązanie białek do hydrofobowych ligandw. Nieco słabsze

są fosforan i chlorek sodu, ktre jednak pozwalają uzyskać zdecydowanie lepszą

selektywność wiązania i elucji białek. Większość białek związanych z hydrofobowym

ligandem daje się stosunkowo łatwo odmyć stosując jako eluent tę samą sl, ale w niższym

stężeniu.

Stężenie jonw wodorowych (wartość pH) jest czynnikiem, ktry musi być

uwzględniany przy optymalizacji rozdziału w technice HIC. Zaobserwowano, że siła

oddziaływań hydrofobowych białka z hydrofobowym ligandem jest tym większa, im niższa

jest wartość pH. Z drugiej strony, podwyższenie wartości pH umożliwia rozbicie

wielopunktowych oddziaływań hydrofobowych pomiędzy makromolekułą a długimi alifa-

tycznymi łańcuchami, gęsto unieruchomionymi na powierzchni nośnika. Jednak wartość pH

powyżej 8,5 sprzyja występowaniu silnych oddziaływań hydrofobowych.

Temperatura odgrywa istotną rolę we właściwym przeprowadzeniu rozdziału HIC.

Oglnie rzecz biorąc obserwuje się znaczne rżnice w selektywności separacji makromolekuł

w rżnych temperaturach. Wynika to stąd, że oddziaływania hydrofobowe makromolekuł

z hydrofobowym ligandem mają charakter sił van der Waalsa, ktre są zależne od

temperatury. Im wyższa temperatura, tym oddziaływania hydrofobowe są silniejsze. Jednak

pewne białka wykazują nieco odmienne właściwości hydrofobowe w funkcji temperatury. Te

odstępstwa od reguły przypisuje się odwrotnym zmianom konformacyjnym i związanym

z nimi zmianom w rozpuszczalności tych białek w funkcji temperatury.

Skład solwentw może decydować zarwno o sile oddziaływań hydrofobowych

makromolekuł z hydrofobowym ligandem, jak i o selektywności tych oddziaływań. Wpływ

rżnych rodzajw i stężeń soli został omwiony powyżej. Zastosowane inne czynniki, takie

jak alkohole i detergenty, zdecydowanie obniżają siłę wiązania białka z ligandami,

konkurując z nimi o miejsca wiążące na ligandzie. Efekt ten może być wykorzystywany do

poprawienia selektywności wiązania i elucji białek. Należy jednak zawsze mieć na uwadze

możliwość denaturacji makromolekuł przez alkohole, oraz trwałe zmiany konformacyjne

dokonywane w strukturze białka przez detergenty. Niezależnie od tego, alkohole i detergenty

mogą być bardzo przydatne w czyszczeniu (sanityzacji) kolumn.

Zalety i wady techniki chromatografii oddziaływań hydrofobowych

Zalety:

- w technice gradientowej objętość prbki nanoszonej na kolumnę może być

wielokrotnie większa od objętości kolumny, a stężenie separowanych substancji

może być bardzo niskie;

- technika ta pozwala na wielokrotne zatężenie wyjściowego materiału;

- pojemność kolumny jest zwykle bardzo duża;

- rozdzielczość metody jest wysoka.

Wady:

- składniki eluowane w solwencie o dużym stężeniu soli muszą być dializowane lub

poddawane rechromatografii techniką filtracji żelowej w celu usunięcia nadmiaru

soli.

6.2. Złoża stosowane w chromatografii oddziaływań hydrofobowych

łoża do chromatografii oddziaływań hydrofobowych rżnią się zarwno rodzajem

nośnika jak i rodzajem oraz długością hydrofobowych ligandw. W tabeli 6.1. zestawiono

niektre właściwości złż najczęściej stosowanych w technice HIC. Należy zwrcić uwagę,

że złoża te zostały przewidziane dla technik chromatografii niskociśnieniowej i nie spełniają

warunkw wymaganych w systemach FPLC lub HPLC. Dla tych systemw przewidziano

złoża, ktrych nośniki charakteryzują się lepszymi parametrami mechanicznymi (tabela 6.2.).

Tabela 6.1.

Zestawienie wybranych złż do chromatografii HIC. Dane na podstawie aktualnego (2000 r.)

katalogu firmy Amersham Pharmacia Biotech.

Phenyl

Sepharose 6 FF

(low /high sub)

Butyl

Sepharose 4 FF

Octyl

Sepharose 4FF

SOURCE

15 PHE

SOURCE

15 ISO

SOURCE

15 ETH

Rodzaj liganda

fenyl

n-butyl

n-octyl

Fenyl

izopropyl

Eter

Powierzchniowa

gęstość liganda

(

20/40

30-40

moli/ml żelu)

Rodzaj nośnika

Sieciowana

agaroza (6%)

sieciowana

agaroza (4%)

sieciowana

agaroza (4%)

polistyren

sieciowany z

dwuwinyloben-

zenem

polistyren

sieciowany z

dwuwinyloben-

zenem

Polistyren

sieciowany z

dwuwinyloben-

zenem

Maksymalne

ciśnienie pracy

złoża (MPa)

0,3

1,5

Pojemność

wiązania

(mg HSA /ml żelu)

24/36

W kolumnie dotyczącej żelu Phenyl Sepharose 6 FF podano dane dla złż o niskiej i wysokiej gęstości powierzchniowej liganda.

Dla szybkiego sprawdzenia warunkw separacji wybranego materiału techniką

chromatografii oddziaływań hydrofobowych, z zastosowaniem złż podanych w tabeli 6.1.,

firma Amersham Pharmacia Biotech oferuje zestaw kolumienek HiTrap HIC . Kolumienki te

(1 ml każda) mogą być użyte w dowolnym systemie chromatograficznym (HPLC, FPLC,

ÄKTA, systemy niskociśnieniowe GradiFrac lub ÄKTA prime ), ale mogą być rwnież

operowane za pomocą zwykłej strzykawki.

Tabela 6.2.

Zestawienie wybranych kolumn do wysokociśnieniowej chromatografii oddziaływań

hydrofobowych. Dane na podstawie katalogu firmy Amersham Pharmacia Biotech (1999 r.).

Alkyl Superose

Phenyl Superose

Rodzaj liganda

Neopentyl

Fenyl

Rodzaj nośnika

Superose 12

Maksymalne ciśnienie (MPa)

2,5

Zakres temperatur ( o C)

4 - 40

4 Î 40

Zakres pH

2 - 13

2 Î 13

Odporność chemiczna

mocznik, chlorowodorek guanidyny,

detergenty, rozpuszczalniki

organiczne

mocznik, chlorowodorek guanidyny,

detergenty, rozpuszczalniki

organiczne

Pojemność wiązania

(mg białka/ ml żelu)

HSA - 60

Chymotrypsynogen Î 50

6.3. Przykłady zastosowań techniki chromatografii oddziaływań

hydrofobowych

Przykład 6.1.

Rozdzielanie

-laktoalbuminy i

-laktoglobuliny z zastosowaniem złoża Phenyl-

Sepharose 6 FF (2)

Wprowadzenie:

Struktura przestrzenna wielu białek podlega zmianom indukowanym obecnością jonw

metali. Zmiany te, poza regulacją funkcji tych białek, prowadzą do zmian ich właściwości

hydrofobowych. Zjawisko to może być wykorzystane do izolowania i oczyszczania białek

Chromatografia - Oddzialywan hydrofobowych.pdf

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: