Monika Kuś środa, godz.8.30, 7.12.2011r.
Aneta Latacz Prowadząca: dr Grażyna Majewska
Paulina Oklejewicz
Sprawozdanie nr.7
Aktywność fotochemiczna chloroplastów.
W Fotosystemie II, tzw. PSII następuje przekształcanie energii wzbudzenia, którą dostarczają fotony światła na energię pary ładunków. Aktywność tego układu można zdefiniować jako ilość elektronów przeniesionych z cząsteczki wody na plastochinon w jednostce czasu, przeliczoną na masę chlorofilu w próbce.
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia było wyizolowanie błon tylakoidów z liści sałaty, oznaczenie zawartości chlorofilu w ich zawiesinie a następnie oznaczenie aktywności fotosystemu II i układu rozszczepiającego wodę.
Sposób wykonania
1) Izolacja błon tylakoidów z liści sałaty
Izolację przeprowadzono w pojemniku z lodem, przy słabym świetle.
Liście sałaty homogenizowano w roztworze zawierającym 50mM Tris-HCl ( pH=4,8), 0,4 M sacharoza i 10 mM NaCl przez 15 s, następnie przefiltrowano przez 4 warstwy gazy i umieszczono w probówkach. Próbki te odwirowano przez 90s, zebrano nadsącz i wirowano dalej prz 7 min. Osad zawieszono w 25 ml 0,2 M roztworu sacharozy i 0,1M KCl, po czym odwirowano kolejny raz przy takich samych parametrach. Uzyskany osad zawieszono w 10 ml ),1M roztworu KCl i pozostawiono w lodzie na ok.5 minut (szok osmotyczny). Następnie dodano 10 ml roztworu zawierającego 0,4M sacharozę i 0,1M KCl, odwirowywano przez 10 minut.
Osad zawieszono w 5ml roztworu zawierającego 0,2M sacharozy i 0,1M KCl, a w następnej kolejności wstawiono do naczynia z lodem.
Zawiesinę rozcieńczono buforem 10Mm Tricyna-NaOH (pH=7,7) z dodatkiem MgCl2 , tak aby stężenie chlorofilu w probówce było w zakresie 20-40 µg/ml. Przygotowaną 10 ml próbkę, przechowywano ją w lodzie i osłonięto przed światłem.
2) Oznaczanie zawartości chlorofilu w zawiesinie tylakoidów
Dokładnie wymieszano zawiesinę tylakoidów. Do dwóch probówek Eppendorfa odmierzono 1 ml zawiesiny i 8 ml acetonu. Odwirowano przez 5 minut. Powstał pomarańczowy osad białka (karotenoidy). Zmierzono absorbancję względem 80% acetonu przy długościach fali: 645 i 663 nm, odpowiadających max. Absopcji Chl a i b przy 710 nm.
Wyniki:
dla 663nm- 0,736
dla 645- 0,255
dla 710-0,027
Obliczono stężenie chlorofilu a i b na podstawie poniższego wzoru:
CChl (a+b) (µg/ml) = 20,2 (A645- A 710) + 8,02 (A663-A710)
CChl (a+b) = 20,02 ( 0,255 – 0,027) + 8,02( 0,736-0,027) = 10,29 µg/ml
10,29 µg – znajduje się w 1ml
X µg- 8 ml
x= 83,33 µg
Mamy 2 ml roztworu, więc : 82,33 x 2 = 164,64 µg
164,64 µg - 400µl
x µg- 1000 µl
x= 411,6 µg/ml
3) Oznaczanie aktywności fotosystemu II i układu rozszczepiającego wodę.
Metodą pomiaru szybkości przekazywania elektronów jest pomiar zmian stężenia utlenionego/zredukowanego donora lub akceptora elektronów w czasie oraz w warunkach umożliwiających zajęcie reakcji.
Akceptorem elektronów z platochinonu jest utleniona forma dichlorofrnoloindofenolu (DCIP), która w maksimum absorpcji (zakres 580-600 nm) przyjmuje intensywnie niebieskofioletowe zabarwienie. W formie zredukowanej jest bezbarwny. Informacji o aktywności fotochemicznej układu PSII dostarcza zatem spadek absorbancji DCIP w oświetlanej zawiesinie błon tylakoidowych.
DCMU jest natomiast substancją hamującą przekazywanie elektronów z PSII do DCIP, poprzez wiązanie się z miejscem redukcji plastochinonu.
Do kuwety spektrofotometrycznej odmierzono 2, 430 ml zawiesiny błon tylakoidów. Dodano 70 µl DCIP i zmierzono absorbancję przy 590 nm. Absorbancja wyniosła 0,396. Następnie próbkę oświetlono wysycającym światłem białym przez kilkadziesiąt sekund i ponownie zmierzono absorbancję. Wyniosła 0,152.
Wniosek
Po 1 minucie oświetlania nastąpiła redukcja DCIP, roztwór zmienił barwę, dlatego absorbancja była mniejsza.
W następnej kolejności przygotowano 2400µl próbki, dodano 30 µl DCMUi zmierzono absorbancję, która wyniosła 0,896. Następnie próbkę oświetlono ikolejny raz zmierzono absorbancję, która tym razem wyniosła 0,878.
Na podstawie otrzymanych wyników oznaczono maksymalną aktywność fotochemiczną PSII w µmolach elektronów x min-1 x µg -1
Obliczenia
1 cząsteczka DCIP została zredukowana przez 2 elektrony
Molowy współczynnik absorpcji DCIPP, e590= 16000 M -1 cm-1
Masy cząsteczkowe:
Chl a = 893,5 g/mol
Chl b= 907,5 g/mol
Stosunek Chl a do Chl b = 3:1
Korzystamy ze wzoru:
A= k x c x l
k= 16000
l= 1cm
30 µg chlorofilu w 1l
300 µg w 10 ml
600 µg w 20 ml
1ml- 411,6µg
x ml- 600 µg
x= 1,46 ml
paulinka88x