MIKROBIOLOGIA_laboratorium_11_Analiza_mikrobiologiczna_POWIETRZA.doc

                       Temat 11: Analiza mikrobiologiczna powietrza

Aby zaliczyć to ćwiczenie student powinien:

wiedzieć, jakie obiekty biologiczne mogą występować w powietrzu oraz jakie czynniki, i jak, na nie działają; wiedzieć, jakie rodzaje zagrożeń wiążą się z obecnością drobnoustrojów w powietrzu; znać i umieć scharakteryzować główne źródła emisji bioaerozolu oraz czynniki wpływające na jego stężenie i rozprzestrzenianie się; znać wady i zalety poszczególnych metod badania zanieczyszczeń mikrobiologicznych powietrza; wiedzieć, jakie drobnoustroje i na jakich pożywkach bada się w ramach sanitarnej analizy powietrza;  znać pojęcia: frakcja respirabilna, hemoliza, mikroorganizmy wskaźnikowe, patogeny oportunistyczne; umieć obliczyć stężenie mikroorganizmów w powietrzu (jako jtk/m3) na podstawie liczby wyrosłych kolonii na pożywce i ocenić stopień zanieczyszczenia badanego powietrza.

       Powietrze jest środowiskiem niesprzyjającym życiu mikroorganizmów, w którym nie mogą one rosnąć i dzielić się. Jest ono jedynie miejscem ich okresowego przebywania i ośrodkiem umożliwiającym przemieszczanie się. Drobnoustroje dostają się do powietrza w wyniku podmuchów wiatru, porywającego je z różnych środowisk (gleby, wody, odpadów, powierzchni roślin, zwierząt i in.), bądź też są tam aktywnie wyrzucane np. podczas kichania, kaszlu, czy w procesie napowietrzania ścieków. Mikroorganizmy zawieszone w powietrzu można traktować jako układ koloidalny - aerozol biologiczny (tzw. bioaerozol), w którym ośrodkiem rozpraszającym jest powietrze, a fazę rozproszoną tworzą drobnoustroje.

      W powietrzu działają 3 podstawowe czynniki ograniczające występowanie mikroorganizmów:

·         brak wystarczającej ilości składników pokarmowych,

·         częsty deficyt wody, grożący wyschnięciem,

·         promieniowanie słoneczne.

     Pierwszy z wymienionych czynników w sposób oczywisty uniemożliwia rozwój każdej komórki. Drobnoustroje w powietrzu są ciągle narażone na wyschnięcie, a bez wody niemożliwe są jakiekolwiek procesy życiowe. Niektóre bakterie są szczególnie wrażliwe na deficyt wody i wysuszenie działa na nie bakteriobójczo (np. dwoinki rzeżączki lub krętki kiły giną zaraz po dostaniu się do powietrza). Wiele mikroorganizmów znosi jednak dobrze deficyt wody i, choć nie mogą wtedy normalnie funkcjonować, to w stanie wysuszenia przeżywają miesiące, a nawet lata (przetrwalniki laseczek, zarodniki grzybów).

       Promieniowanie słoneczne również działa szkodliwie na drobnoustroje zawieszone w powietrzu, ponieważ powoduje powstawanie mutacji i przyczynia się do wysychania komórek (w wodzie i glebie światło jest zwykle słabe lub nie ma go wcale).

     Przystosowanie mikroorganizmów do przebywania w powietrzu

     W atmosferze najdłużej mogą przebywać te formy, które ze względu na swoją budowę lub skład chemiczny są odporne na wysychanie i działanie promieniowania słonecznego. Można je podzielić na następujące grupy:

·         formy przetrwalne bakterii,

·         formy wegetatywne bakterii wytwarzające barwniki karotenoidowe lub specjalne warstwy ochronne (otoczki, specjalna budowa ściany komórkowej)

·         zarodniki grzybów,

·         wirusy mające otoczkę.

     Oczywiście, oprócz wymienionych form szczególnie odpornych, w powietrzu występują też bardziej wrażliwe komórki i wirusy, ale ich żywotność jest dużo mniejsza. Uważa się, że spośród form wegetatywnych, bakterie gramdodatnie wykazują większą odporność niż gramujemne (zwłaszcza na wysuszenie), ze względu na grubszą ścianę komórkową. Poza tym, wirusy są zwykle bardziej odporne niż bakterie.

      Przeżywalność i rozprzestrzenianie się bioaerozoli     

     Drobnoustroje po opuszczeniu swojego pierwotnego miejsca zasiedlenia i przedostaniu się do powietrza, są nagle poddane działaniu licznych czynników niesprzyjających przeżyciu i część z nich ginie od razu, głównie z powodu wysuszenia. Te, które przeżyją stres nagłej zmiany warunków życia, są jednak nadal poddawane ich działaniu i z czasem zamierają. Na przeżywalność mikroorganizmów w powietrzu wpływają następujące czynniki:

·         odporność właściwa dla danego drobnoustroju,

·         warunki meteorologiczne (m.in. wilgotność względna, temperatura, promieniowanie słoneczne),

·         zanieczyszczenia powietrza,

·         czas przebywania w powietrzu.

       Jednym z głównych czynników warunkujących przeżywalność jest zawartość wody w powietrzu. Przy bardzo niskiej wilgotności i wysokiej temperaturze komórkom grozi wysuszenie, natomiast wysoka wilgotność może chronić komórki przed napromieniowaniem, poprzez jego absorpcję. Drobnoustroje różnie reagują na stopień wilgotności powietrza, choć dla większości z nich korzystniejsze warunki przetrwania stwarza wysoka wilgotność.

     Temperatura może działać pośrednio, poprzez zmianę wilgotności względnej powietrza (im wyższa temperatura, tym niższa wilgotność względna) lub bezpośrednio, powodując w skrajnych przypadkach wysuszenie komórek i denaturację białek (temperatury wysokie) albo krystalizację wody zawartej w komórkach (temperatury poniżej 0oC). Wynika z tego, że optymalne dla bioaerozolu są temperatury niskie, ale powyżej 0oC. (według niektórych badaczy ok. 15oC).

     Promieniowanie słoneczne ma negatywny wpływ na przeżywalność bioaerozolu, zarówno jako światło widzialne, jak i promieniowanie podczerwone i ultrafioletowe (UV). Jest tak z następujących przyczyn:

·         powoduje ono powstawanie mutacji,

·         powoduje powstawanie wolnych rodników, które uszkadzają ważne makromolekuły,

·         stwarza zagrożenie wysuszeniem.

      Obecne w powietrzu zanieczyszczenia, zwłaszcza węglowodory, ozon i tlenki azotu, aktywowane promieniowaniem słonecznym (szczególnie UV) tworzą różnorodne, silnie reaktywne zanieczyszczenia wtórne, określane ogólnie jako utleniacze fotochemiczne (m.in. azotan peroksyacetylu - PAN). Działają one toksycznie na wszelkie formy życia, w tym i na mikroorganizmy zawieszone w powietrzu. Natomiast nietoksyczne aerozole niebiologiczne (pyły, mgły), rozpraszają i absorbują promieniowanie słoneczne i przez to zwiększają szansę przeżycia bioaerozolu.     

      Należy zaznaczyć, że omówione wyżej czynniki działają równocześnie i często są ze sobą

powiązane, np. promieniowanie słoneczne zwiększa temperaturę, a wysoka wilgotność osłabia promieniowanie.

     Stężenie mikroorganizmów w powietrzu

     O stężeniu bioaerozolu, czyli stopniu zanieczyszczenia mikrobiologicznego powietrza, decydują m. in. następujące czynniki:

·         wielkość emisji drobnoustrojów, zależna od źródła emisji,

·         odległość od źródła emisji,

·         prędkość wiatru,

·         przeżywalność drobnoustrojów (zależna od czynników omówionych wyżej),

·         opady atmosferyczne.

     Wielkość emisji i skład gatunkowy emitowanego bioaerozolu zależy od źródła emisji. Różne mogą być czynniki wpływające na stężenie początkowe powstającego bioaerozolu. Np. dla komory napowietrzania biologicznej oczyszczalni ścieków są to m. in.: stężenie mikroorganizmów w ściekach i sposób ich napowietrzania.

      Powstały bioaerozol rozprzestrzenia się podobnie jak aerozol niebiologiczny (np. pył zawieszony) z tą różnicą, że mikroorganizmy z czasem zamierają. Wiejący wiatr rozrzedza aerozol i powoduje, że jego stężenie na zawietrznej od źródła emisji spada wraz z oddalaniem się od niego. Dodatkowymi czynnikami zmniejszającymi stężenie bioaerozolu jest grawitacja, działająca głównie na większe cząstki, i opady atmosferyczne, niekiedy radykalnie redukujące stężenie aerozolu (po intensywnych opadach deszczu lub śniegu, powietrze jest praktycznie wolne od drobnoustrojów).

     Zagrożenia związane z obecnością drobnoustrojów w powietrzu

      Można wyróżnić następujące grupy zagrożeń:

·         Choroby zakaźne: wirusowe, bakteryjne, grzybowe i pierwotniacze,

·         Choroby alergiczne,

·         Zatrucia (np. endotoksyny i mikotoksyny). 

      Główne źródła emisji bioaerozolu

     Można wyróżnić dwa podstawowe źródła bioaerozolu:

·         naturalne

·         bytowe (związane z działalnością człowieka)

     Źródła naturalne to przede wszystkim gleba i woda, z których mikroorganizmy są wynoszone przez ruchy powietrza, a także organizmy, np. grzyby emitujące olbrzymie ilości zarodników roznoszonych przez wiatr. A więc w powietrzu istnieje zawsze pewna liczba drobnoustrojów tworząca naturalne tło.

      Z higienicznego punktu widzenia, ważniejsze od naturalnych są bytowe źródła bioaerozolu, związane z działalnością człowieka. Emisje z tych źródeł są niebezpieczne z dwóch powodów:

·         mogą rozprzestrzeniać drobnoustroje patogenne (chorobotwórcze),

·         często powodują silne zwiększenie liczebności mikroorganizmów w powietrzu, znacznie przekraczające naturalne tło.

      Źródła emisji aerozolu biologicznego mogą mieć charakter punktowy (np. komora napowietrzania ścieków) lub powierzchniowy (np. pole nawadniane ściekami).   

      Do najważniejszych źródeł bioaerozolu należą:

·         rolnictwo i przemysł rolno-spożywczy,

·         oczyszczanie ścieków,

·         gospodarka odpadami (składowiska i kompostownie),

      Rolnictwo i przemysł rolno-spożywczy

       Pod względem wielkości emisji jest to najpoważniejsze źródło bioaerozolu, będące efektem intensyfikacji metod produkcji rolnej. Aerozol powstaje podczas wykonywania większości prac rolniczych, np. zbioru plonów, w czasie transportu, przechowywania i przerobu surowców roślinnych i zwierzęcych, oraz w pomieszczeniach hodowlanych.

       Do najważniejszych składników tego aerozolu należą:

·         grzyby pleśniowe, m. in. tzw. grzyby przechowalniane (Aspergillus, Penicillium) i tzw. grzyby polowe (Cladosporium i Alternaria), najpospolitsze grzyby w powietrzu,

·         pałeczki gramujemne, głównie z rodzaju Ervinia,

·         promieniowce termofilne,

·         pył pochodzenia biologicznego (m. in. fragmenty naskórka, pierza, cząstki wydalin i pył  roślinny).

      Ekspozycja na taki aerozol często powoduje przewlekłe choroby układu oddechowego, np. alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych.

      Oczyszczanie ścieków

      Wielkość emisji bioaerozolu zależy tu m. in. od składu ścieków, przepustowości oczyszczalni, metody oczyszczania i rodzaju stosowanych urządzeń technologicznych. Sprzyjające warunki do tworzenia się bioaerozolu powstają zwłaszcza przy wylewaniu ścieków, ich napowietrzaniu, mieszaniu i rozpryskiwaniu. Skład jakościowy powstałej mikroflory powietrza jest ściśle związany ze składem oczyszczanych ścieków.

     Za najbardziej specyficzne dla bioaerozoli ściekowych uważa się bakterie jelitowe (pałeczki z grupy coli, pałeczki durowe) i wirusy jelitowe, gdyż zazwyczaj nie spotyka się ich w powietrzu po stronie nawietrznej oczyszczalni. Z tego powodu uważa się je za mikroorganizmy wskaźnikowe, pomocne w wyznaczaniu strefy oddziaływania oczyszczalni na środowisko.

     Gospodarka odpadami

      Źródłem emisji bioaerozolu są różne formy gospadarki odpadami m. in.: składowanie odpadów i kompostownie.

     Składowanie odpadów

     W powietrzu wokół składowisk występują głównie pospolite w przyrodzie bakterie i grzyby saprofityczne pochodzenia glebowego i wodnego, z których część ma charakter patogenów oportunistycznych. Oznacza to, że w sprzyjających warunkach (osłabienie układu odpornościowego, wniknięcie do organizmu w dużej ilości) mogą one wywołać u człowieka stan chorobowy. Dobrymi mikroorganizmami wskaźnikowymi oddziaływania składowisk na otoczenie są grzyby ciepłolubne (rosnące w temp. 37oC) i keratynolityczne (rozkładające keratynę).

     Kompostownie

     Kompostownie również emitują duże ilości drobnoustrojów, zwłaszcza bakterii. Szczególnie duże zanieczyszczenie powietrza powstaje przy sortowaniu odpadów, gdzie liczne są bakterie gramujemne, potencjalnie niebezpieczne dla człowieka. Dobrym wskaźnikiem oddziaływania kompostowni na otoczenie jest pospolity w kompoście grzyb pleśniowy - kropidlak popielaty (Aspergillus fumigatus).

      Wykrywanie obecności drobnoustrojów w powietrzu

      Stosowane metody można podzielić umownie na:

·         mikroskopowe

·         hodowlane.

     Niekiedy stosowane metody mają charakter pośredni lub używa się jednocześnie obu metod.

      Metody mikroskopowe

      Polegają one na:

·         przepuszczaniu powietrza przez filtr membranowy bądź umieszczaniu na drodze zasysanego powietrza szkiełka powleczonego lepką substancją (np. wazeliną),

·         barwieniu wyłapanych drobnoustrojów i

·         badaniu mikroskopowym, polegającym głównie na liczeniu komórek.

      Zalety metod mikroskopowych są następujące:

·         możliwość wykrycia w powietrzu nie tylko żywych, ale i martwych mikroorganizmów,

·         możliwość wykrycia także tych drobnoustrojów, które niechętnie wyrastają na pożywkach; dzięki temu oznaczenia liczby drobnoustrojów są zwykle przynajmniej o rząd wielkości wyższe, niż w metodach hodowlanych,

·         można wykryć i zidentyfikować inne obiekty biologiczne, np.: pyłki roślin, alergogenne roztocze, nieożywiony pył organiczny ( fragmenty naskórka, piór, roślin)

     Jednak metody te mają poważną wadę: niemożność identyfikacji gatunkowej mikroorganizmów (bakterii, grzybów, wirusów).

     Metody hodowlane

     Metody te polegają na przeniesieniu mikroorganizmów z powietrza na powierzchnię odpowiedniej pożywki. Po okresie inkubacji w optymalnej temperaturze, liczy się wyrosłe kolonie i podaje wynik jako liczbę jednostek tworzących kolonie przypadających na 1 m3 powietrza (jtk/m3 lub cfu/m3 - z ang. colony ...