EMBRIO KOLOS 2.docx

Zajęcia 7:

Materiałem biologicznym badanym przy użyciu histologicznym może być:
- skrawki tkanek – pozyskujemy ich okołooperacyjnie, pośmiertnie,
- wymazy, rozmazy,
- odciski narządów,
- całe organizmy, formy rozwojowe,
- pojedyncze komórki, np. jajowa,

po zdobyciu komórek trzeba je utrwalić:
- przy użyciu utrwalaczy chemicznych płynnych,
- wysycenie krwioprotentantami a potem zamrożenie,
- substancjami chemicznymi np. niskoczaseteczkowy jak formalina, wysokocząsteczkowy
utrwalacze nie są obojętne wobec tkanek, tkanki pęcznieją.
niektóre utrwalacze mogą zawierać rozpuszczalniki i to rzutuje na technikę przy utrwalaniu i barwienia

utrwalacze proste tylko jeden komponent
utrwalacza złożone jest więcej komponentów

utrwalacze sole metali ciężkich, kwasy, substancje organiczne

- kwas pikrynowy,
- kwas octowy,
- kwas osmowy, a konkretnie jego bezwodnik osmowy.

substancje organiczne:
- formalina,
- etanol.

sole metali ciężkich:
- dwuchlorek rtęci,
- dwuchromian potasu.

Utrwalacze chemiczne:
są ograniczenie, nie niszczy ale mogę się wytrącać i tworzyć złogi, nie powinno się wiec trzymać bardzo długo w utrwalaczu. Najmniejsze graniczenie ma etanol ale nie zawsze się stosuje

Utrwalacz trzeba następnie zmyć z preparatu, płuczemy w bieżącej wodzie, ale te z kwasów pikrynowych zmywa się alkoholem, potem preparat trzeba odwodnić preparat, bo go zamoczyć w parafinie.
preparaty można przechowywać baaardzo długo w 70% etanolu.

Odwadnianie tkanek:
preparat odwodnimy np. za pomocą etanolu robiąc rozcieńczenia, perzpułukując w kolejnych alkoholach od słabego do mocnego. Potem są płyny pośrednie np. ksylen, ksylenem płuczemy. Zmieniamy na zmianę przepłukując ksylenem i ostatecznie mamy odwodniony preparat.
Można jeszcze płukać metanolem lub ?

Mamy przesycony preparat ksylenem (ksylen rozpuszcza siew  parafinie, umożliwia migracje parafiny do preparatu).
Ale nie można włożyć preparatu naszczącego ksylenem tak był nasiąknięty jak gąbka.
im więcej ksylenu tym bardziej płynna parafina. Trzeba znów płukać ksylen, by było go mnie. Przepłukujemy w różnych parafinach na końcu w parafinie twardej.

Zasada metody zatapiania w parafinie – jedno z najczęstszych pytań na kolokwiach !!!

Widoczność przez parafinę:
chcemy widzieć tkanki, dlatego zatapiamy w parafinie by łatwiej ciąć.
do zatapiany by było baaardzo twarde to np. żywice akrylowe, by uzyskać cieńsze skrawki nic przy użyciu parafiny.
do krojenia używamy mikroton (jak te maszynki do krojenia szynki w sklepie)
kriostat – mikroton w komorze chłodniczej
ultramikrotony – używane są tu noże szklane lub diamentowe, do mikroskopów elektronowych

Po pokrojeniu na plasterki trzeba zanim się położy na szkiełko trzeba preparować szkiełka
można pokryć szkiełka klejami, np. kurzym białkiem z glicerolem,
cienki plasterek skrawka parafinowego się pofalowuje, trzeba wiec to rozprostować, trzeba zamoczyć preparat, potem trzeba więc podgrzać szkiełko  i podgrzewany, by rozprostować preparat i osuszyć z wody .
umieszczamy to potem w pudełku i opisujemy

Wszystko już gotowe teraz barwienie:
są różne barwienia, najróżniejsze.
barwienia histologiczne:
większość barwników rozpuszcza się w wodzie, niektóre w alkoholu.
najpierw trzeba od parafinować, wiec trzeba potraktować ksylenem, i potem uwodnić znów alkoholem od najmocniejszego do najsłabszego na końcu płuczemy wodą.

podział barwników ze względu na ich budowę,
jest podział ze względu na charakter chemiczny barwnika czyli co on wybarwiają:
- b. zasadowe – Hematoksylina, czerwień ? wybarwiają błonę komórkową, maja powinowactwo do kwaśnych części w komórce,
- b. kwasowe – oozyna
- b. obojętne – wybarwiają konkretne rzeczy, np. Sudany, czerwień oleista

podział ze względu na ilość barwników:
- barwienia pojedyncze – 1 barwnik, są to barwienia topograficzne
- barwienia złożone, 2 lub więcej barwników – barwienie AB PAS ??

wyjmujemy z ostatniego barwnika, ocieka barwnikiem, potem nieco osuszamy,  wkładamy na szkiełko i przykładamy szkiełkiem na nakrywkowym. Stosujemy tu substancję specjalne płyny np. balsam kanadyjski, syntetyczna żywica DTX wszystko na bazie lub z dodatkiem ksylenu. nie zawsze można użyć każdego.

Po barwieniu czasem można opłukać wodą i przykleić balsamem
przy DTX niemożna użyć wody, można tu użyć ksylenu albo alkoholami odwadniając stężenie rosnące a potem ksylen i DTX

Zajęcia 8:

Płyny utrwalające:
- płyn Karnoja, szybko przenika przez tkanki, preparaty do barwienia prawie wszystkimi barwnikami, pospuszcza tłuszcze i lipidy
- formalina – najczęściej stosowany utrwalacz najczęściej, 4% roztwór, preparaty trąca kolor, ścina białko, szybko przenika, mało zmienia strukturę komórki, po niej można utrwalać w innych utrwalaczach, zachowuje tłuszcze i lipidy, wady: pęcznienie tkanki łącznej, wytrącanie się aldehydów, co utrudnia barwienie, powstają złogi bogatych  w krwinki tkanek , nieprzyjemny zapach, szkodliwa dla zdrowia, powoduje rozpuszczanie substancji w komórkach
- płyn Ciacho – główną część tego płynu stanowi formalina, kwas octowy, nie rozpuszcza tłuszczy i lipidów, zachowuje jądra komórkowe, rzadko używany,
- płyn Błena – prawie uniwersalny utrwalacz, nienadane się do wykrywania kwasów nukleinowych , jest jednym z głównie stosowanych utrwalaczy chemicznych, utrwala się nim od małych do dużych skrawek, odwadnia tkanki, , wady: powoduje pęcznienie tknaki łacznej, skąłd: kwas pikrynowy (daje żółta barwę) (jest wybuchowy w kryształkach), formalina, aldehyd glutarowy , woda i inne.

Przygotowywanie preparatu do oglądania pod mikroskopem:
1. Rozmazać kroplę białka na szkiełko.
2. Kilka kropel wody na szkiełko dla rozprostowania skrawka preparatu.
3. Pociąć kilka plasterków preparatu na ostrzu.
4. Delikatnie z włosem zebrać z ostrza preparat i przenieść na szkiełko.
5. Położyć na blat grzewczy by woda odparował.
6. Preparat włożyć do cieplarki by dokładniej wyschła, tak wysuszone preparaty można trzymać nawet kilka czy kilkanaście lat.

Zatapianie preparatu w parafinie:
1. Centrum do zatapiania.
2. Ceramiczne kuwetki wysmarować gliceryną, by parafina się do niej nie przykleiła
3. Wkładamy preparat do ceramicznej kuwety.
4. Zatapiamy preparat parafiną tak by znajdował się na środku. (można najpierw położyć preparat i go zalać, albo najpierw nalać trochę parafiny, poczekać aż przestygnie, a następnie położyć preparat i całkiem zalać).
5. Stawiamy kuwetkę na polu zimnym by parafina zgęstniała.
6. Krzepnąca parafina się kurczy, dlatego preparat musi być na środku, a nie z boku, by nie wystawał.
7. Gdy już parafina będzie zimna można ją delikatnie wyjąć z kuwetki, podważając ją.
8. Po wyjęciu preparatu kuwetkę należy przetrzeć z gliceryny.

Zajęcia 9:

Barwienie Hematoksylina i Eozyna:
1. Ksylen I               3-4min                            } odparafinowanie 
2. Ksylen II               3-4min                            } odparafinowanie 
3. Alkohol 99%               2-3min                            } uwodnienie
4. Alkohol 96%              2-3min                            } uwodnienie
5. Alkohol 90%              2-3min                            } uwodnienie
6. Alkohol 80%              2-3min                            } uwodnienie
7. Alkohol 70%              2-3min                            } uwodnienie
8. Alkohol 50%              2-3min                            } uwodnienie
9. Opłukać wodą w zlewce
10. Hematoksylina Enricha 5-10min – barwnik zasadowy, barwi jądra komórkowe na niebiesko
11. Bieżąca woda kilka sekund
12. Alkohol kwaśny 70% + HCl
13. Płukanie w zlewce do niebieskiego zabarwienia
14. Eozyna – barwnik kwaśny, barwi cytoplazmę na czerwono
15.woda w zlewce
16. Alkohol 70%              2-3min                            } odwodnienie
17. Alkohol 80%              2-3min                            } odwodnienie
18. Alkohol 90%              2-3min                            } odwodnienie
19. Alkohol 96%              2-3min                            } odwodnienie
20. Alkohol 99%               2-3min                            } odwodnienie
21. Alkohol 99%               2-3min                            } odwodnienie             (to nie jest błędne powtórzenie)
22. Ksylen I                             3-4min                             } prześwietlenie
23. Ksylen II                             3-4min                            } prześwietlenie
24. Zaklejenie – balsam kanadyjski lub DPX

Zajęcia 10:

Barwienie tłuszczów obojętnych czerwienią oleistą (oil red) wg Lillie’a:
Materiał: skrawki mrożone
Barwienie:
1. Przygotowany na świeżo oil red – 10min
2. Opłukać wodą destylowaną
3. Hematoksylina Enricha – 5min
4. Opłukać woda bieżącą
5. Zakleić glicerożelem.
Wynik: tłuszcze – czerwone, jądra komórkowe – niebieskie
Oil red – roztwór alkoholowy i rozpuścić 0,5g zerwieni oleistej w 100ml 98% alkoholu izopropylowego.
Przed użyciem wpuścić 6ml barwnika w 4ml wody. Odstawić na 10 min, a następnie filtrować.

Zajęcia 11:

Na przyszłym kolokwium można się spodziewać:
TECHNIKI HISTOLOGICZNE: pobieranie materiały, barwienie, wykańczanie preparatu. :
UTRWALANIE: utrwalacze: 2 utrwalacze najbardziej podstawowe: formalina (zalety, wady, gdzie się ją stosuje, gdzie niemożna), płyn gouina (zalety, wady, stosowanie, przeciwwskazania)
ETAPY PŁYKANIA PRUBEK: uwadnianie, odwadnianie (cały materiał, a nie barwienie, to są procedury histologiczne)
ZATAPIANIE MATERIAŁY ( materiał zatapiany w parafinie)
KROJENIE SKRAWKÓW: skrawki parafinowe na mikrotomie, krojenie na kriostacie (skrawki mrożone), w celu uzyskania ultra cienkich skrawków zatapia się skrawki w żywicach, tnie się je na ultra mikrotomie
podział na barwniki zasadowe, kwaśne i obojętne:
zasadowy: hematoksylina
kwaśny/kwasowy: eozyna
obojętny: oil red (czerwień oleista)
ZNAĆ PO DWA Z KAŻDEGO
WYKAŃCZANIE SKRAWKÓW, ZAKLEJANIE: DPX, balsam kanadyjski (niszczą enzymy i lipidy), glicerożel przy skrawkach mrożeniowych.
ZATAPIANIE W PARAFINMIE : pobieranie materiału, utrwalanie, przelewanie przez płyny pośrednie, płukanie po utrwalanie, odwadnianie przez szereg alkoholi, ksyleny (prześwietlanie)
zatapianie w parafinie z ksylenem, po 24 godzinach zatapianie w parafinę zwykłą, po 24 godzinach zatapianie w parafinie, przeprowadzanie przeg szereg ksylenów 3 ksyleny po 1 godzinie.

BARWIENIA:
1. hematoksylina – eozyna:  barwniki: eozyna (czerwona)(cutoplazma) i hematoksylina (niebieska)(jądro komórkowe)
2. barwienie AB PAS: barwienie 2 etapowe stopowane do wybarwiania komórek śluzowych : barwnik błękit alcjanu PAS: kwas nadjodowy + odczynnik Schiffa, wynik barwienia śluz na kolor niebieskawy
3. barwienie potrójne:
hematoksylina, chlorek żelaza i pirofuksyna, barwienie i różnicowanie włókien tkanki łącznej i mięśni , wynik barwienia: jądra komórkowe – czarno brunatne, cytoplazma – żółto-zielona, włókna kolagenowe – czerwone, włókna sprężyste- żółte, mięśnie – żółto-brudntne
4. metoda NGG: metoda May  - Grunwald – Giemsy: barwniki: eozyna, błękit metylenowy i azur metylowy
barwienie rozmazy krwi i szpiku kostnego, erytrocyty różowe, jądra leukocytów – czerwono- filetowe, cytoplazma limfocytów – błękitna, cytoplazma leukocytów – różowa.
5. Metoda barwienie skrawków mrożeniowych – barwienie czerwienią oleistą i hematoksylina zaklejamy glicerożelem, barwienie na tłuszcze , tłuszcz na czerwono, jądra komórkowe na niebiesko.