Zagadnienia na immunochemie
1. Cukrowe antygeny bakteryjne
2. Wielocukry otoczkowe (kapsularne) bakterii G+ i G- (CPS)
Gram –
W skład jej otoczki wchodzą polisacharydy kapsularne CPS (wchodzi jeszcze EPS). Zakotwiczone jest w warstwie lipidowej zewnętrznej za pomocą łączników lipidowych. Zawierać może nawet do 90% wody, chroni komórkę przed odwodnieniem i utrudnia rozpoznanie epitopów znajdujących się na powierzchni ściany komórkowej przez układ odpornościowy gospodarza. Wykazują także silne właściwości antygenowe. Bierze udział w produkcji biofilmów ułatwiając bakterii adhezję do komórek gospodarza. Wykorzystywana jest wraz z EPS do produkcji sprzężonych szczepionek.
3. Endotoksyny (lipopolisacharydy) bakterie G-
Jest to zewnętrzna błona prawie wszystkich bakterii G-. Nadają bakteriom zdolność do adhezji do nabłonków (prawdopodobnie przez powtarzające się cukrowe podjednostki w O-antygenie). Spełnia dużą rolę w życiu bakterii biorące udział w różnych biologicznych procesach. Chroni przed mechanizmami obronnymi gospodarza a wraz z białkami ostrej fazy z surowicy (we krwi) powodują wydzielanie się czynników martwicy nowotworów (TNF alfa), interleukiny, prostaglandyny, wolne rodniki, czynniki aktywujące płytki krwi, czyli spełnia też rolę chorobotwórczą. Uwolnienie LPS powoduje wstrząs endotoksyczny. Mamy dwa typy LPS: S, gdy w jego skład wchodzi lipid A i R, gdy pozbawiony jest części antygenowej.
4. Schemat budowy endotoksyn
Zbudowane z 3 części: Hydrofobowego lipidu A, oligosacharydowego rdzenia, dystalnie położony polisacharydowy łańcuch O-swoisty (O-antygen). Najbardziej konserwatywną jest lipid A (potem rdzeń i łańcuch O-swoisty). Lipid A jest najbardziej konserwowaną częścią. Jest zbudowany z disacharydu, D-glukozoaminylo-β-(1→6)-D-glukozaminy, podstawionej czterema resztami kwasów tłuszczowych, często jest to kwas β-hydroksymirystylowy. Grupy hydroksylowe kwasów tłuszczowych, przy nieredukującej cząsteczce glukozaminy, zazwyczaj estrowo związane są z kolejnymi długołańcuchowymi resztami kwasów tłuszczowych. Disacharyd jest podstawiony dwiema grupami fosforanowymi, z których jedna jest związana estrowo przy końcu nieredukującym, a druga α-glikozydowo przy końcu redukującym. Jest to najprostsza struktura z hydrofilowym szkieletem cukrowym oraz 4 cząsteczkami kwasów tłuszczowych typu (R-)-hydroksy, która warunkuje aktywność endotoksyczną.
Rdzeń, może być mniej lub bardziej złożony, nawet w obrębie tego samego gatunku. Często wyróżnia się dwie części: proksymalny do lipidu A rdzeń wewnętrzny i dystalny rdzeń zewnętrzny, który może wykazywać większą heterogenność strukturalną. W rdzeniu wewnętrznym zawsze jest przynajmniej jedna reszta Kdo, pochodna tego związku lub rzadko substancja analogiczna do Kdo. (Kdo- nie występuje w komórkach eukariotycznych, dlatego szlak jego syntezy lub włączenie go do LPS stanowi potencjalny cel dla antybiotyków. Brak Kdo jest letalny dla komórki). Rdzeń zewnętrznym występuje w LPS przedstawicieli Enterobacteriaceae, u innych występuje sporadycznie. Np. Salmonella ma trzy szeregowo połączone heksozy.
O-swoiste łańcuchy polisacharydowe (OPS) determinują właściwości serologiczne LPS. Są to głównie cukry obojętne i aminocukry, ale również cukry nietypowe jak dideoksyheksozy – abekwoza, kolitoza czy tyweloza. Charakteryzują się duża zmiennością strukturalną i różnicami w sekwencji cukrowców, podstawników i rodzajach wiązań determinujących swoistość serologiczną LPS, który jest bardzo ważnym antygenem powierzchniowym (antygen O). Długość części o-swoistej LPS często decyduje o wyglądzie kolonii bakterii.
5. Badania strukturalne lipopolisacharydów (LPS) – endotoksyny
-Poznanie struktury LPS wymaga zbadania składu chemicznego zarówno komponenty lipidowej, jak i sacharydowej. W lipidzie A wskazane jest ustalenie rodzaju budującej go jednostki aminocukrowej, typu i liczby kwasów tłuszczowych wraz ze sposobem ich połączenia w badanej strukturze oraz zweryfikowanie tezy o występowaniu innych komponentów w tym fragmencie LPS, np. grup fosforanowych lub etanoloaminy. Określenie struktury fragmentu węglowodanowego wymaga oznaczenia składu chemicznego, typu i anomerii wiązań, konfiguracji i konformacji składników monocukrowych. *Zachodzi w procesach, które mogą degradować jednocześnie LPS. Gdy ulegnie rozpadowi to widmo mas ujawni nam widma jej degradaji. Aby było możliwe analizowanie węglowodanów za pomocą chromatografii gazowej należy wpierw przeprowadzić je w formy lotne. Dokonuje się tego poprzez metylację i acetylację grup hydroksylowych sacharydu. Niezwykle użyteczną we wstępnych badaniach struktury LPS jest chromatografia gazowo – cieczowa w połączeniu ze spektrometrią mas. Chromatografia gazowo – cieczowo pozwala nam na ustalenie profilu cukrowego LPS, położenia wiązań glikozydowych, a po częściowej hydrolizie dostarcza nam informacje na temat struktury wyjściowego polisacharydu. W celu zabezpieczenia wszystkich wolnych grup hydroksylowych poddaje się je przekształceniu w grupy metoksy i dalej doprowadza się do hydrolizy oligosacharydu w kwaśnym środowisku. Powstałe wolne monosacharydy są redukowane do alditoli, które są acetylowane na nowo powstałych resztach hydroksylowych. W wyniku jonizacji powstają z monosacharydów serie jonów. Dzięki tej technice można też określić konfigurację absolutną monosacharydów. *Analizując profil rdzeniowy i O-antygenu i rdzenia należy pozbyć się składnika polisacharydowego w lipidzie A stosujemy łagodną hydrolizę wiązania ketozydowego. *Informacji o położeniu wiązań glikozydowych dostarcza nam derywatyzacja komponeny cukrowej endotoksyn do alditoli, które następnie zostają zacetylowane. Hydrolizę wiązań glikozydowych można prowadzi w HCl, H2SO4, TFA. *Redukcja gr karboksylowych i znakowanie ich deuterem pozwala na odróżnienie ich od innych cukrów. *Analiza metylacyjna – stosowana do określenia typów wiązań glikozydowych w oligsacharydach. W ten sposób otrzymuje się per-O-metylowe oligosacharydy, które przekształca się w zmetylowane monosacharydy. *Spektometria mas – z jonizacją strumieniem elektronów w połączeniu z analizą metylacyjną pozwala ustalić skład monosacharydowy badanego cukru złożonego.
NMR – spektroskopia
MALDI – TOF - spektroskopia
6. Hodowla bakterii, izolacja LPS, oczyszczanie
IZOLACJA LPS
LPS można wyizolować za pomocą rozdziału elektroforetycznego w żelu poliakrylamidowym lipopolisacharydu z fazy fenolowej i wodnej. Izolowane są z gładkich form bakterii, niezależnie od pochodzenia.
OCZYSZCZANIE
Oczyszczono za pomocą enzymów nukleolitycznych i ultrawirowania. Metodą chromatografii powinowactwa.
7. Elektroforeza w żelu z detergentem (SDS, PAGE)
Elektroforeza to metoda analizowania i rozdzielania koloidów wykorzystując ruch naładowanych cząstek koloidowych w polu elektrycznym.
Elektroforeza w PAGE – w żelu akrylamidowym, stosowana do rozdzielania i analizowania małych fragmentów DNA. Także do rozdzielania jednoniciowych RNA. Żel powstaje w wyniku polimeryzacji monomerów akryl amidowych w długie łańcuchy, które następnie są łączone kowalencyjnie ze sobą (dzięki siarczany amonu i TEMED). Wielkość porów w żelu zależy od stężenia akrylamidu. Rozdział prowadzony jest w buforze 1xTBE a jego przebieg można śledzić dzięki barwnikowi w żelu. Maja bardzo dużą zdolność rozdzielczą (różnice 1pz).
8. Izolacja fragmentów cząsteczki LPS
Izolacja fragmentów LPS często zachodzi w środowisku, w jakim bywa także degradowane. Częsci poli i oligosacharydów można otrzymać w wyniku łagodnej hydrolizy na złożu BioGel P-10. Izolować można także poprzez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym, wybarwiając następnie otrzymane frakcje LPS srebrem.
9. Oczyszczanie (flitracja żelowa, chromatografia jonowymienna, chromatografia powinowactwa)
Filtracja żelowa - Filtracja żelowa, zwana także chromatografią żelową, stosowana jest do rozdziału białek różniących się masą cząsteczkową i kształtem oraz do oddzielania białek od składników niskocząsteczkowych np. sole (odsalanie). Do filtracji żelowej używamy szklanych rur wypełnionych kulistymi cząsteczkami żelu o średnicy 10-500 µm. Małe cząsteczki i średnie (zielone i niebieskie) mieszaniny wnikają w głąb porowatych ziaren, duże (czerwone) natomiast nie wnikają. Cząsteczki o najmniejszym ciężarze cząsteczkowym mają do pokonania najdłuższą drogę i dlatego wypływają najpóźniej z kolumny. Białka o dużej masie cząsteczkowej i o efektywnej średnicy większej niż pory ziaren złoża mają do pokonania krótszą drogę w żelu i wędrują najszybciej. Pojawiają się, zatem jako pierwsze u wylotu kolumny.
Chromatografia jonowymienna - Chromatografia jonowymienna jest jedną z najbardziej popularnych metod rozdziału mieszanin wieloskładnikowych, której istotą jest rozdział białek wykorzystujący różnicę w ładunku elektrycznym. Rozdział białek na kolumnie jonowymiennej następuje na podstawie odwracalnej adsorpcji białek na kolumnie. Białko, którego wypadkowy ładunek w obojętnym pH jest dodatni, będzie się wiązać z wymieniaczem jonowym poprzez jego grupy karboksylowe (z kationitem). Niezwiązane z kolumną związki (np. białka o ładunku ujemnym) zostaną wypłukane. Związane białka o ładunku dodatnim wymywa się z kolumny np. buforem o zwiększającym się stężeniu chlorku sodu.
Chromatografia powinowactwa - Jest szczególnym typem chromatografii adsorpcyjnej. Ze względu na swe unikalne właściwości pozwala znacznie uprościć procedurę izolowania wybranej substancji, przy jednoczesnym zachowaniu jej biologicznej aktywności. Ogólne zasady tej metody są przedstawione na rysunku. Zasadniczym elementem tej techniki jest obecność liganda w kolumnie, specyficznego względem interesującego nas białka. (Ligandem jest tu trójkąt połączony z granulką nośnika); próbka natomiast zawiera białka, w których występuje miejsce trójkąty, kółka i kwadraty. Białko z miejscem na trójkąt łączy się z ligandem a reszta przechodzi przez kolumnę (nie maja powinowactwa do tego liganda). Następnie przemywamy kolumnę nadmiarem tego liganda by oczyścić ją z zatrzymanego białka. Mamy różne powinowactwa: do enzymu, lektyn, immobilizowanego metalu, z wykorzystaniem barwników.
10. Cukry, aldozy, ketozy, aminocukry, deoksycukry, kwasy urynowe, onowe…
Cukry – to inaczej węglowodany, związki węgla i wody. Sacharydy dzielimy na cukry proste (monosacharydy) i złożone (oligo i polisacharydy). Ich funkcje to: zapasowe, energetyczne, transportowa, budulcowa, wchodzi w skład DNA i RNA, hamuje krzepnięcie krwi. Ze względu na grupy funkcujne mamy:
Alzody – zawierają grupę aldehydową (CHO). Najprostsza aldoza ma 3 węgle – aldotrioza. Np. ryboza, glukoza, galaktoza. Odbarwiają wodę bromową i ulegają reakcji Tollensa i Tromera.
Ketozy – zawierają grupę ketonową (C=O). Tu ketoza z 3 węglami to ketotrioza. Są cukrami redukującymi, gdyż grupa ketonowa w tych cukrach ulega enolizacji, tworząc epimery (dwie aldozy i jedną ketozę). Dają reakcję z odczynnikiem Benedicta i Fehlinga oraz próbą Tollensa jednak nie odbarwiają wody bromowej.
Aminocukry – pochodne cukrów, które zawierają jedną lub rzadziej kilka grup aminowych (–NH2) w miejscu występowania grupy hydroksylowej. Występuje u nich wiązanie N-glikozydowe. Najważniejsze aminocukry to glukozamina i kwas neuraminowy. Aminocukry występujące w przyrodzie, mogą mieć grupę aminową zarówno przy C2, jak i pozycjach 3, 4, 5 lub 6 cukru. Mogą łączyć się w poliaminocukry, czego przykładem jest chityna. Mogą łączyć się w poliaminocukry.
Deoksycukry - cukry proste, w których cząsteczce brak jednego z atomów tlenu; np. deoksyryboza, deoksymannoza (ramnoza), deoksygalaktoza (fukoza). Wchodzą w skład różnych glikozydów i glikoproteidów.
Kwasy uronowe - grupa kwasów cukrowych pochodnych aldoz, w których końcowa grupa hydroksylowa została utleniona do grupy karboksylowej. Wchodzą w skład polisacharydów i glikozydów w organizmie oraz śluzów roślinnych. Ulegają mutarotacji, tworzą glikozydy, zachowują właściwości redukujące. Biorą udział w procesie biotransformacji ksenobiotyków.
Kwasy onowe – powstają z aldoz pod wpływem utleniania solami Ag2+ lub Cu2+ (odczynniki Tollensa i Fehlinga).
11. Absolutna konfiguracja, anomeria wiązania glikozydowego
Anomeria – jest cechą wszystkich monosacharydów. Wykazują mutarotację w roztworach. Aldozy tworzą formy prionowe a ketozy furanowe. Pierścienie tworzą heksozy i pentozy. Cyklizacja powoduje powstanie dodatkowego centrum asymetrii i w ten sposób mamy anomery α i β (w glukozie powstanie dodatkowej gr. OH przy C1 dla ketoz będzie to C2). (Mutarotacja – przejście jednej formy w drugą). Anomer α posiada grupę –OH przy tzw. anomerycznym atomie węgla skierowaną w dół, a anomer β – w górę. Ustalić ją można za pomocą metody analizy metylacyjnej. Metoda polega na wykorzystaniu zjawiska różnej reaktywności wiązań - i -D-glikozydowych w procesie utleniania za pomocą CrO3 w środowisku kwasu octowego. Ponieważ wiązanie posiada dwa atomy tlenu umieszczone blisko siebie (pochodzące z pierścienia i wiązania glikozydowego) jest bardziej prawdopodobne, że ulegnie szybciej utlenieniu niż wiązanie . Dalsza analiza polega porównaniu składu sacharydu przed i po procesie utleniania za pomocą GC/MS. Obecność nieprzereagowanych cukrów sugeruje występowanie wiązania -glikozydowego
Konfiguracja absolutna – określamy ją w celu poznania tego czy cząsteczka cukru należy do szeregu D czy L. Ostatni asymetryczny atom węgla w cząsteczce to tzw. atom odniesienia. Jeżeli podstawnik, dla cukrów grupa –OH, jest po stronie prawej, to jest to izomer D, jeżeli po stronie lewej – izomer L.
12. Depolimeryzacja polimerów cukrowych
Depolimeryzacja polega na degradacji polimerów do monomeru pod wpływem wysokiej temperatury lub pod wpływem czynników hydrolizujących.
Celuloza – jest polisacharydem. Może być zhydrolizowana przez enzymy degradujące enzymy β – glikozydowe (u zwierząt roślinożernych w przewodzie pokarmowym). Jej produktem depolimeryzacji jest D – glukoza. Rozkładana pod wpływem roztworów kwasowych. Krótkie działanie HCl powoduje rozpad do amyloidu. Hydroliza pod wpływem bezwodnika octanowego w obecności stężonego H2SO4 prowadzi do powstania dwusacharydu celobiozy (z tego wynika, że celuloza zbudowana jest z cegiełek celobiozowych). Na celulozę można też działa kwasami mineralnymi (np. solny, siarkowy) w wyniku, czego powstaje hydroceluloza.
Skrobia – zbudowana jest z amylopektyny (80%) i amylozy (20%). Amylopektyna – jest mocno rozgałęziona. Zawiera także reszty kwasu fosforanowego związane estrowo. Zbudowana z glukoz połączonych ze sobą połączonych wiązaniami α-1,4- i α-1,6-glikozydowym w rozgałęzione łańcuchy. Amyloza stanowi ok. 20% masy skrobi. Zbudowana jest z kilku tysięcy pierścieni glukozy, połączonych wiązaniem α-1,4-glikozydowym w nierozgałęzione łańcuchy. W wodzie tworzy roztwór koloidalny (skrobia rozpuszczalna), z jodem barwi się na ciemnoniebiesko. Enzymy z klasy amylaz rozkładają wiązania. Np. α – amylaza rozkłada wiązania α-1->4 glikozydowe hydrolizując amylozę i amylopektynę stopniowo do dekstryn (alfa glukoza, maltoza, dekstryny graniczne). Nie rozkłada maltozy. Β – Amylaza hydrolizuje, co drugie wiązanie α-1->4 glikozydowe zmieniając konfigurację α przy C1 w β. Dostarczają głównie β-maltozy oraz pozostawiają silnie rozgałęziony polisacharyd zawierający nienaruszone wiązania α-1,6-glikozydowe (tzw. dekstryny graniczne). Amylopektynę rozkładają w 50%.
13. Analiza cukrowa, etapy, analiza widm GC MS
(GC/MS) – to połączenie dwóch technik do analizy związków organicznych i śladowych ilości lotnych związków organicznych. Chromatograf rozdziela analizowaną mieszaninę na składniki w czasie, a spektrometr mas rejestruje ich widma pasmowe. Ogólny schemat działania GC/MS
Analiza ...
Petroc