biotechnologia 2 AC.docx

LABORATORIUM BIOTECHNOLOGII OGÓLNEJ

Biotechnologia

środa godz. 815-1200

Adam Cuperek

Katarzyna Świątek

Paulina Kij

ĆWICZENIE nr 2

BIOSYNTEZA α-AMYLAZY BAKTERYJNEJ W HODOWLI WSTRZĄSNEJ

1.                 Wstęp teoretyczny

Produkcja enzymów pochodzenia mikrobiologicznego jest typowym procesem biotechnologicznym. Obecnie większość enzymów wytwarzana jest metodami hodowli wgłębnych, ponieważ powoduje to lepsze napowietrzanie, mniejsze ryzyko infekcji, zwiększoną wydajność czy możliwość większej automatyzacji i komputeryzacji. Enzym α-amylaza otrzymywany jest między innymi w hodowli szczepu Bacillus licheniformis metodą wgłębną w kolbach wstrząsanych. W metodzie wgłębnej obserwuje się wzrost w całej pożywce, w całej jej objętości. Hodowla wstrząsana stosowana jest przede wszystkim w fazie badań, gdyż pozwala na ocenę wpływu różnych składników na przebieg biosyntezy. Można badać wpływ np. natlenienia czy składników podłoża, zmieniając ilość jednego składnika, na biosyntezę enzymu. Podstawowymi parametrami, na które należy zwrócić uwagę podczas procesu biosyntezy enzymu w wgłębnych hodowlach drobnoustrojów są: pH środowiska hodowlanego, temperatura hodowli, stopień napowietrzania oraz szybkość mieszania cieczy hodowlanej.

α-amylaza jest enzymem, który hydrolizuje wiązanie α-1-4-glikozydowe skrobi. Są to enzymy o małej specyficzności działania. Produkcja α-amylazy bakteryjnej odbywa się najczęściej w temperaturze 30-40. Hodowle Bacillus wytwarzających α-amylazę zaliczane są do procesów o wysokim zapotrzebowaniu tlenu. α-amylaza bakteryjna znalazła zastosowanie w wielu gałęziach przemysłu

2.                 Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest poznanie zasad prowadzenia procesu biosyntezy enzymu w hodowli

wstrząsanej oraz poznanie wpływu składu podłoża na wydajność procesu.

3.                 Metodyka

3.1.          Materiał biologiczny

Do hodowli należy zastosować szczep Bacillus licheniformis. Szczep ten, przechowywany na skosach agarowych w temperaturze 4 uaktywniono wcześniej przez przeniesienie na świeże skosy i inkubację w temperaturze 39 przez 24 godziny. Uaktywniony szczep stanowił inokulum dla hodowli wstrząsanej.

3.2.          Przygotowanie pożywki hodowlanej i warunki hodowli

Pożywki hodowlane przygotowano wcześniej w kolbach kulistych płaskodennych (500 cm3), wypełnione w 10% pożywką. Składniki podłoża hodowlanego były stałe:

- peptobak (aminobak)  1,25%

- namok kukurydziany   0,35%

- CaCl2                          0,0125%

- NaCl                            0,20%             

- (NH4)2HPO4                    0,30%

Zmienna była natomiast ilość laktozy w poszczególnych kolbach:

1.                 0,5%

2.                 1%

3.                 2%

4.                 3%

Kolbę dopełniono do 100% wodą.

Przed wykonaniem ćwiczenia pożywki w kolbach zaszczepiono inokulum, przez przeniesienie do każdej kolby szczepu ze skosów w ilości „1 eza”. Zaszczepione kolby przeniesiono na wstrząsarki, gdzie prowadzono hodowlę przy parametrach: 240 obrotów/min, amplituda 4,5 cm, temperatura 39, czas procesu 40 godzin. Po zakończeniu hodowli kolby przed bezpośrednim oznaczeniem ilości wytworzonego produktu (tzn. α-amylazy) rozcieńczono odpowiednio: 0,5% laktozy – 200-krotnie, 1% laktozy – 200-krotnie, 2% laktozy – 400-krotnie, 3% laktozy – 500-krotnie.

3.3.          Metody oznaczeń

3.3.1.   Oznaczenie aktywności α-amylazy

Do zajścia reakcji wykorzystano roztwór skrobi rozpuszczonej, którą dodano do roztworu enzymu (o odpowiednim rozcieńczeniu : 0,5%, 1%,2%, 3%).Po 3 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej reakcję przerwano dodając roztworu kwasu 3,5- dinitrosalicylowego (DNS). Na 5 min umieszczono mieszaninę na wrzącej łaźni wodnej po czym schodzono i dodano wody destylowanej. Jednocześnie wykonano próbę kontrolną w której zamiast enzymu użyto wody. Aby oznaczyć aktywność wykonano pomiar absorbancji spektrofotometrycznie przy długości fali 540nm wobec próby kontrolnej.

3.3.2.   Oznaczenie wzrostu biomasy

Oznaczenie wzrostu biomasy wykonano przez pomiar zmętnienia zawiesiny hodowlanej po rozcieńczeniu próbki wodą w stosunku 1:20. Pomiar wykonano dla pożywek hodowlanych o różnej zawartości laktozy. Pomiar przeprowadzono na spektokolorymetrze „Specol” przy długości fali 535 nm wobec próby kontrolnej – wody.

4.                 Wyniki

4.1.          Mojej grupy

4.1.1.   Aktywność α-amylazy

Wyniki pomiaru  ekstynkcji E540 badanych próbek:

Zmierzone wartości pomnożono przez 4 ( „K” współczynnik wynikający z krzywej wzorcowej sporządzonej dla wodzianu maltozy) oraz odpowiednie rozcieńczenie. Ostateczny wynik, aktywność enzymu, otrzymuje się w jednostkach F-S/cm3.

4.1.2.   Pomiar biomasy

Wyniki pomiary dla długości fali 535 nm

Zmierzone wartości pomnożono przez 20 (  współczynnik wynikający z rozcieńczeń prób ).

4.2.          Wszystkich grup