sprawko.doc

Katarzyna Kowalczyk

Monika Łoś

Marta Ryder

ĆWICZENIE 3

BIOSYNTEZA PROTEINAZ BAKTERYJNYCH W FERMENTORACH

1.    WSTĘP TEORETYCZNY

Proteinazy – jest to grupa enzymów proteolitycznych, które katalizują  hydrolizę wiązań peptydowych oraz estrowych. Przekształcają białka, co powoduje włączanie lub wyłączanie ich aktywności biologicznej. Proteinazy serynowe są najlepiej scharakteryzowaną grypą enzymów. Stanowią one najliczniejszą grupę enzymów proteolitycznych występujących w przyrodzie mają także znacząca rolę biologiczną.

      Subtilizyny- alkaliczne proteinazy pozakomórkowe wytwarzane przez bakterie Bacillus

      subtilis.

Bioreaktor (fermentor) – jest to urządzenie umożliwiające prowadzenie procesów mikrobiologicznych, enzymatycznych jak również hodowle komórek organizmów wielokomórkowych, skonstruowane w sposób umożliwiający, poprzez pomiar i regulację parametrów, kontrolę procesu produkcyjnego i jego optymalny przebieg, w warunkach maksymalnego ograniczenia lub całkowitego wyeliminowania możliwości zakażeń

W warunkach laboratoryjnych stosuje się bioreaktory o różnych pojemności roboczej.

Popularne są bioreaktory do hodowli wgłębnych, które zapewniają optymalne warunki mieszania i napowietrzania. Możemy w nim wyróżnić dwa typy mieszania: mikro mieszanie i makro mieszanie. Ważnym parametrem związanym z mieszaniem jest szybkość obrotu mieszadła. Mieszanie musi zapewniać dobre warunki wymiany gazowej. Jeżeli są te warunki spełnione, pozostałe parametry mieszania jak rozkład stężenia substratów, produktów oraz dyfuzja w podłożu nie stanowią czynników ograniczających szybkość procesu biologicznego lub zakłócających ich przebieg.

Dość dużym problemem jest piana. Powstawanie i utrzymywanie się piany uzależnione jest od składu i właściwości fizykochemicznych środowiska oraz od intensywności mieszania się dwóch faz: ciekłej i gazowej. Redukcję pienistości powoduje: degradacja i asymilacja składników podłoża, zmiana pH, obniżenie lepkości i wzrost napięcia powierzchniowego. Piana po osiągnięciu minimum, zazwyczaj ponownie wzrasta pod koniec procesu. Dobór środka przeciwpianowego uzależniony jest od składu podłoża, użytego drobnoustroju i produkowanego metabolitu. Oprócz chemicznych mamy także mechaniczne metody niszczenia piany.

Przykładowy bioreaktor

2.    CEL ĆWICZENIA

Badanie dynamiki biosyntezy proteinaz przez szczep Bacillus subtilis oraz poznanie ogólnych zasad prowadzenia hodowli drobnoustrojów  w fermentorach.

3.    MATERIAŁY I METODY

Szczep przechowywano na podłożu stałym w temperaturze 4°C. Materiał posiewowy do zaszczepienia inokulum stanowi biomasa bakteryjna uaktywniona w 24 godzinnej hodowli statycznej w temperaturze 37 °C. Inokulum otrzymuje się przez 21-24-godzinną hodowlę wstrząsaną bakterii na podłożu N w kolbach kulistych, płaskodennych o pojemności 500 ml zawierających 100 ml pożywki w temperaturze 30°C.

4.OZNACZANIE ZMĘTNIENIA CIECZY.

       Pomiar zmętnienia umożliwia kontrolowanie wzrostu w fermentorze.

     WYKONANIE OZNACZENIA:

  Do wykonania zadaniaotzrymano 6 próbek z hodowli Bacillus subtilis, każda próbka różniła się czasem hodowli: 1-24h hodowli, 2-36h, 3-48h, 4-54h, 5-62h, 6-72h.

Każdą z próbek rozcieńczono 20-krotnie. Pobrano 0,5 ml cieczy i 9,5 ml wody destylowanej następnie zmierzono absorbancję na „spekolu” przy długości fali 660 nm, próbą odniesienia była próbka z wodą destylowaną. Na podstawie otrzymanych wyników otrzymanej absorbancji oblicza się zmętnienie dla poszczególnych próbek ze wzoru:

Moja grupa przeprowadziła pomiary dla próbek numer 4, 5, 6.

5.OZNACZANIE AKTYWNOŚCI PROTEINAZ METODĄ ANSONA

Próbki takie same ja w oznaczaniu zmętnienia cieczy. Na każdą próbkę robiono próbę właściwa i próbę kontrolną.

PRÓBA WŁAŚCIWA

Wprowadzono do próbki 1ml substratu- hemoglobiny, której pH wynosiło 10,2 i 0,2 ml enzymu( jest to ciecz hodowlana po rozcieńczeniu 20-krotnym) i pozostawiono na 10min. Po tym czasie dodano 2 ml kwasu trójchlorooctowego, mieszaninę zamieszano i odstawiona na 30 min w temperaturze pokojowej. Po upływie tego czasu każdą próbkę sączono. Otrzymano w ten sposób przesącz.

      PRÓBA KONTROLNA

Do próbki wprowadzono 1 ml hemoglobiny o pH=10,2  i 2 ml kwasu trójchlorooctowego. Próbkę zamieszano i pozostawiono na 3 min w temperaturze pokojowej. Po tym czasie dodano 0,2 ml enzymu, całość zamieszano i odstawiono na 30 min a następnie roztwór przesączono.

FILTRAT Z PRÓBY WŁAŚCIWEJ I PRÓBY KONTROLNEJ

Pobrano po 1 ml z każdej próbki, następnie dodano 2 ml 0,6-molowego NaOH oraz 0,6ml odczynnika Folina(1:2). Próbki odstawiono na 10 min a następnie zmierzono absorbancję próby właściwej względem próby kontrolnej przy długości fali 690 nm.

Aktywności proteinazy obliczamy ze wzoru:

      gdzie:

A- jest to taka ilość enzymu która w standardowych warunkach uwalnia z tyrozyny ciągu 1 minuty taką ilość produktów rozpuszczalnych w TCA.

      R- rozcieńczenie, R=20

      K- współczynnik, który pozwala na przeliczenie absorbancji na µmoltyrozyny/(min×ml)=0,75