eznymy 16-20.doc

(1590 KB) Pobierz

DROBNOUSTROJE PRZEMYSLOWE – CHARATKERYSTYKA I ŹRÓDŁA POZYSKIWANIA:

16. Metody oznaczania AK N- i C- końcowych

Metody ozn. AK N- koncowych:
1) z FDNB (metoda Sangena))

Następuje tu degradacja całego białka – poznamy tu tylko AK N- końc. 2) z fenyloizotiocjanianem (met. Edmana)

PTM – fenylotiokarbamiloaminokwas 3) z chlorkiem dansylu (met. Graya)

4) z cyjanianem potasu (met. Starka)

Analiza AK C-końc. 1) metoda enzymatyczna z wykorzystaniem karboksyl-peptydazy A (odszczepia C-końc. AK aromat. i duże reszty alifatyczne) i karboksypeptydazy B (odszczepia C-konc. AK zasad.)

2) met. chemiczna – hydroliza białka np.:

Są to metody mało wydajne

17. Metody oznaczaczania masy czastecz. Enzymów

1) chemiczne – analiza składu AK białka. Oznacz. masy min. Mmin = (m ot.pierwiastka/%pierwiastka w białku)*100% np. pomiar hemoglobiny Fe = 0,34%
M at.= 55,85% M min =(55,85/0,34)*100%=16426 Da Ta met. nie umozliwia określenia masy białek oligomerycznych. Wyliczenie na podst. Składu chem. I sekwencji AK. 2) fizykochemiczne – wykorzystuja cechy fiz.- chem badanych białek a) pomiar ciśnienia osmotycznego b) pomiar szybkości c) pomiar sedymentacji. Wzor Sredberga M = (RTS/D(1-V*ρ)) gdzie D-wsp. Dyfuzji, ρ- gęstość rozp. V- czast. V oraz
S = (1/w^2(t2-t1))- ln (x2/x1) gdzie S wsp. Sedymentacji, w-predkośc kątowa ln – odległość sedyment. Warstwy białka od osi obrotu w czast. d) za pomocą filtracji żelowej – w przypadku gdy mamy kolumnę ze zlożem SEFADX lub BIOŻEL możemy oznaczyć miarę – masę czast. Najpierw przepuszcz. Błękit dekstrynowy, który nie wnika do żelu bo jest za cieżki i pozostaje w eluacie. On umozliwia oblicz. Vo kolumny. Równoważymy kolumnę wzorc. – substancję np. pepsyna przepuszczamy przez kolumne i wyznacz. Obj. Ve (elucyjną).

W ten sposób wyznaczamy mase bialka. Najdokladniejsza met. to wyznaczanie masy po genie białka.e) PAGE w warunkach denaturujących (denaturuje bialko). Do bialka dodajemy 1-2% SDS (detergent anionowy zapewnia naladowanie czast. bialka (-). Jedna ujemnie naladow. czast. SDSu przypada na 2 czast. AK w białku. Merkaptoetanol 1% niszczy silne wiąz. Disiarczkowe. 5 min. inkubacja we wrzącej łażni. Po denaturacji przeprowadzamy SDS, PAGE. Do probówek dodajemy błękit branofenylowy. Aby wyznaczyc m czast. stosujemy niskoprocentowy żel rozdzielający. Dzieki blekitowi widac w którym momencie zachodzi migracja gdy na dole przerywamy elektroforeze. W procesie dodajemy subst. Do obciążania próby. Uzyskujemy obraz elektroforetyczny. Rm – wsp. ruchliwości elektroforetycznej Rm =(odległość przebyta przez białko/odległość przebyta przez marker) *x*(dł. Żelu przed wybarwieniem/dł żelu po wybarwieniu).

18. Ogólna charakt. enzymów proteolitycznych

Mechanizmy reakcji katalizowanych przez enzymy 1)hydraty peptydowe (we wszystkich org. żywych) 2)egzopeptydazy-dziela się na 5 grup ze wzg. Na centrum aktywne. Wśród proteinaz występują enzymy o tej samej specyficzności ale różnym mech. Katalitycznym np. proteinazy serynowe (centrum akt. Seryna). Otoczenie centrum akt. Jest środowiskiem zakonserwowanym. Na koncu takiego enz. Wystepuje Gly (Gly-X-Ser-Y-Gly) •proteinazy cysternowe – gr. katalitycz. jest SH. •proteinazy aspartylowe – są 2 centra katalit. bedące resztami kw. aspartylowego. •metaloproteinazy – kompleksja z jonami Zn2+ •treoinowe – rolę katalityczną spelnia gr. OH. Enzymy sklasyfikowane są w klany
->rodziny->podrodziny->przedstawiciele. W sklad rodzin wchodzą nie tylko proteinazy i peptydazy. W podziale tym znaczenie ma pokrewieństwo ewolucyjne i homologiczny układ AK. Wszystkie proteinazy serynowe katalizują proces w oparciu o przeniesienie ładunku. W większości klas wystepują w centrum aktywnym triada Aminokwasowi. Mechanizm dzialania proteinaz serynowych najlepiej obrazuje dzialanie chymotrypsyny. •chymotrypsyna- enzym trawienny trzustki w org. w postaci nieaktywnego białka chymotrypsynogenu, ktoty aktyw. się w jelicie. Tnie wiązania zewnatrz reszt peptydowych w AK aromat. (Phe,Try,Trp) oraz w Met, Leu. Powstają oligopeptydy, mające na C-końcu w/w AK. Chymotrypsyna jest białkiem z 2 domenami. Enzymem homologicznym do chymotrypsyny jest elastaza, są podobne pod wzdledem sekwencji 3-wymiar. W szczelinie katalitycznej chymotrypsyny znajduje się triplet AK 57His, 102 kw Asp, 159 Ser. Triada ta powoduje przeniesienie ładunku i utrzymywana jest przez wiązania wodorowe.

Takie cięcie umożliwia zmianę konformacji enzymu przez wycięcie 2 polipeptydów, co umożliwia odpowiednie usytuowanie centrum aktywnego. •Trypsyna- aktyw. jest na drodze proteolit. Przez wycięcie 6 polipeptydów aby uzyskać dostęp do kieszeni katalitycznej. Budowa kieszeni katalitycznej:

Chymotrypsyna we wnęce 1 zawiera reszty Gly. Elastaza we wnece 1 reszty waliny i treoniny i tu dostanie się mała reszta substratu np. alaniny. W większości proteinaz występują dodatkowe miejsca wiążące wykorzystujące powinowactwo do reszt poprzedzających lub następujących. –Rn-2-Rn-1<-Rn->Rn+1-Rn+2. Zależność ta badana była przy uzyciu substr. syntetyczn.