MIKROBIOLOGIA – NOTATKI
1. PODŁOŻA MIKROBIOLOGICZNE.
Podłoże mikrobiologiczne to sztucznie stworzone środowisko wzrostu do hodowli drobnoustrojów.
Są stosowane w stosunku do drobnoustrojów do:
· izolacji
· różnicowania
· identyfikacji
· namnażania
· określania właściwości fizjologicznych, biochemicznych i hodowlanych
· otrzymywania produktów metabolizmu
Cechy podłoży do hodowli drobnoustrojów:
· zawierają łatwo dostępne źródła pierwiastków biogennych (C, O, H, N, P, S), energii i soli mineralnych
· odpowiednie pH i potencjał redox
· przejrzystość (z wyjątkiem podłoży zawierających związki nierozpuszczalne np. tłuszcze czy CaCO3)
· odpowiednie ciśnienie osmotyczne
· jałowość
Podziały podłoży:
Zasadniczo można podzielić podłoża na zwykłe (podstawowe), jak bulion, woda peptonowa czy brzeczka, służące do hodowli drobnoustrojów i do przygotowywania podłoży drugiego typu – podłoży specjalnych, które służą do izolacji i identyfikacji drobnoustrojów.
Podłoża można też dzielić:
a) ze względu na zawartość składników odżywczych
· minimalne – zawierają tylko składniki pokarmowe służące do podtrzymania wzrostu drobnoustrojów (np. podłoże M9)
· pełne – zawierają wszystkie niezbędne substancje odżywcze umożliwiające dobry wzrost drobnoustrojów (źródło węgla, azotu, sole mineralne i czynniki wzrostowe). Jest to np. bulion do hodowli bakterii lub brzeczka do hodowli drożdży
· wzbogacone – są sporządzane dla drobnoustrojów słabo rosnących in vitro, które w tych warunkach wymagają do wzrostu dodatkowych substancji odżywczych
b) ze względu na skład chemiczny
· naturalne – podłoża o nie w pełni znanym składzie chemicznym, jak np. bulion, brzeczka, mleko. Są to podłoża pełne.
· półsyntetyczne – podłoża o częściowo znanym składzie, np. podłoże M9 wg Adamsa wzbogacone glukozą i autolizatem drożdży służące do hodowli bakterii Proteus i Escherichia. Mogą to być podłoża minimalne, pełne lub wzbogacone.
· syntetyczne – podłoża o w pełni określonym składzie, np. podłoże z mannitolem do hodowli Azotobacter. Mogą to być podłoża minimalne, pełne lub wzbogacone.
c) ze względu na konsystencję
· stałe – zawierają 1,5-2% agaru; służą do namnażania i (głównie) do różnicowania bakterii
· półpłynne – zawierają 0,1-0,7% agaru; służą np. do badania ruchu bakterii
· płynne – bez agaru; służą do namnażania drobnoustrojów
d) ze względu na przeznaczenie i zastosowanie
· namnażające – służą do otrzymywania dużej biomasy określonych szczepów. Zwykle płynne
· wybiórcze – z dodatkiem związku(ów) hamującego wzrost konkretnej grupy drobnoustrojów
· namnażająco-wybiórcze – pozwalają na namnożenie się tylko jednego gatunku lub jednej grupy mikroorganizmów, znajdujących się w posiewanym materiale. Zawierają związki hamujące wzrost jednej grupy mikroorganizmów, a ułatwiające wzrost innej. Przykłady:
o podłoże bezazotowe z mannitolem do hodowli bakterii wiążących N2 z atmosfery
o podłoże z kwaśnym selenianem sodu do hodowli E. coli i do namnażania Salmonella sp. z kału lub próbek żywności
o podłoże Kauffmana z czterotionianem sodu i żółcią – hamuje wzrost bakterii kałowych, oprócz Salmonella sp.
· izolacyjne – podłoża stałe zawierające związek (identyfikator) pozwalający odróżnić od siebie kolonie bakterii. Przykłady:
o płytka Endo z laktozą do diagnozy Enterobacteriaceae
o podłoże Chapmana z mannitolem do hodowli gronkowców
o podłoże Clauberga z tellurynem potasu do hodowli Corynebacterium sp.
· identyfikacyjne – podłoża do badania właściwości biochemicznych bakterii
· transportowe – podłoża do zabezpieczania materiału na czas przenoszenia od pacjenta do laboratorium, będące zwykle zbuforowanymi podłożami minimalnymi, bez składników odżywczych – tylko z solami mineralnymi.
2. STERYLIZACJA
Sterylizacja (wyjaławianie) to proces zabijania drobnoustrojów zarówno w formie wegetatywnej i przetrwalnej.
Zastosowanie sterylizacji:
· w placówkach medycznych
· przy produkcji leków,
· przy produkcji płynów infuzyjnych, preparatów krwiopodobnych i protez
· przy produkcji materiałów opatrunkowych
Metody sterylizacji
a) fizyczna
· wysoką temperaturą (sterylizacja cieplna)
o sucha
§ wyjaławianie przez wyżarzanie – spalanie drobnoustrojów w płomieniu palnika; do wyjaławianie ezy i igieł preparacyjnych przed i po szczepieniu pożywki. Trzeba rozgrzać do czerwoności
§ wyjaławianie przez opalanie – opalanie w płomieniu palnika brzegów kolb i probówek oraz bagietek, głaszczek szklanych, szkiełek podstawowych do preparatów mikroskopowych. Ponadto skalpele, łopatki metalowe, pensety, grube igły sterylizuje się przez zanurzenie w etanolu i opalenie w płomieniu palnika.
§ wyjaławianie gorącym suchym powietrzem – przeprowadza się w suszarkach:
° w 140°C przez 2,5 h
° w 160°C przez 2 h
° w 180°C przez 1 h
Służy do wyjaławiania szkła laboratoryjnego, materiałów trwałych, przedmiotów stalowych, materiałów sypkich itp.
Przygotowanie szkła do steryzlizacji tą metodą:
° probówki zakrywa się korkami z waty, ligniny lub metalowymi
° kolby zakrywa się korkami z ligniny lub „kołderkami” i kawałkami folii aluminiowej
° płytki Petrieo i pipety zawija się w papier lub umieszca się w metalowych tubusach (ustniki pipet zabezpiecza się dodatkowo wacikami)
o mokra (parą wodną)
§ dekoktacja (wyjaławianie przez gotowanie) – niegdyś używana na większą skalę do sterylizacji instrumentów chirurgicznych i zabiegowych, dziś powinna być ograniczona jedynie do wyjątkowych sytuacji i przy użyciu wody destylowanej. Nie eliminuje wirusów zapalenia wątroby i przetrwalników bakterii.
§ pasteryzacja – działanie wysokiej temperatury poniżej 100°C. Niszczy formy wegetatywne drobnoustrojów obecnych w środowisku płynnym (np. mleko, piwo, soki itp). Ma na celu zniszczenie drobnoustrojów chorobotwórczych i przedłużenie ważności produktów spożywczych. Wyróżnia się:
° pasteryzację niską (długotrwałą) – ogrzewanie w temperaturze 63-65°C przez 0,5 h
° pasteryzację wysoką (szybką) – ogrzewanie w temperaturze 72°C przez 15 s (płyn przepływa cienką warstwą przez specjalny aparat) lub 90°C (wtedy bez zatrzymywania w aparacie)
° obróbkę termiczną UHT (Ultra High Temperature) stosującą dwie metody:
v pasteryzację szybką HTST (High Temperature Short Time)
v pasteryzację ultraszybką – ogrzewanie mleka (przepływającego cienką warstwą w aparacie) w temperaturze 130-150°C
Otrzymywanie mleka zupełnie jałowego z inaktywowanymi wirusami pryszczycy. Mleko poddawane metodzie UHT musi być czyste mikrobiologicznie i pozbawione enzymów bakteryjnych. Jej wadami są gorzknienie mleka, koagulacja jego białek i częściowy rozkład.
Każda metoda pasteryzacji kończy się gwałtownych schłodzeniem produktu, tak aby nie stracił wartości odżywczych
§ tyndalizacja – proces trzykrotnej sterylizacji w odstępach 24-godzinnych. Przeprowadza się ją w aparacie Kocha i polega na działaniu gorącej pary wodnej. Przebieg sterylizacji:
1) ogrzewanie w temperaturze 100°C przez 0,5 h
2) inkubacja podłoża w cieplarce w temperaturze 32°C na 24 h (wykiełkowanie przetrwalników)
3) drugie ogrzewanie w temperaturze 100°C przez 0,5 h (zabicie wykiełkowanych form)
4) inkubacja podłoża w cieplarce w temperaturze 32°C na 24 h (wykiełkowanie potencjalnych przetrwalników, które przeżyły)
5) trzecie ogrzewanie w temperaturze 100°C przez 0,5 h
Pojedyncza sterylizacja w temperaturze 100°C przez 0,5 h nie niszczy przetrwalników.
§ wyjaławianie za pomocą pary wodnej pod zwiększonym ciśnieniem – sterylizacja wysoką temperaturą uzyskaną po sprężeniu nasyconej pary wodnej w odpowietrzonym autoklawie. Metoda używana w stosunku do produktów, które nie ulegają rozkładowi w temperaturze powyżej 100°C. Polega na uwalnianiu ciepła kondensacji podczas skraplania pary wodnej na chłodniejszych przedmiotach (dlatego potrzebne jest odpowietrzenie – w jego obecności skropleniu towarzyszy obniżanie temperatury). Używa się nadciśnienia 0,8-1,6 atm, co odpowiada 177-127°C.
Do sterylizacji drobnych narzędzi (np. w aptekach, laboratoriach itp.) używa się szybkowarów.
Procesowi wyjaławiania podlegają produkty zawierające całe populacje drobnoustrojów (a nie pojedyncze komórki).
Czas śmierci cieplnej – czas potrzebny do zabicia wszystkich drobnoustrojów tego samego gatunku przy określonej temperaturze i składzie pożywki.Punkt śmierci cieplnej – temperatura, która zabija hodowlę bakteryjną w ciągu 10 minut.
· promieniowanie
o za pomocą promieni UV – promieniowanie UV o zakresie fal 230-270 nm wykazuje silne działanie bakteriobójcze lub mutagenne. Szczególnie promieniowanie o długości fali 260 nm jest pochłaniane przez zasady azotowe DNA i aminokwasy aromatyczne białek, z tym, że najbardziej wrażliwe są formy wegetatywne (szczególnie w fazie logarytmicznego wzrostu). Promieniowanie powoduje powstawanie dimerów T, C oraz T z C tej samej nici DNA, co prowadzi do zaburzeń replikacji. Bakterie mogą się chronić przed mutagennym działaniem promieni UV przez:
§ fotoreaktywację – rozszczepianie dimerów T przez fotolizazy
§ reperację ciemną – wycięcie uszkodzonego DNA i zastąpienie go prawidłowym
Promieniowanie UV jest stosowane także do sterylizacji pomieszczeń. Działa powierzchniowo.
o sterylizacja radiacyjna – niszczenie drobnoustrojów za pomocą promieniowania jonizującego, głównie promieni X i γ w dawce 1-3 megaradów. Niszczy ono bakterie prawdopodobnie przez destrukcję struktury DNA i radiolizę wody. Jako źródło promieniowania wykorzystuje się izotopy (głównie kobalt 60) i akceleratory elektronów. Tą metodą można sterylizować:
§ sprzęt medyczny
§ protezy biologiczne
§ katgut
§ materiały opatrunkowe
§ leki i farmaceutyki
§ produkty spożywcze (suche)
§ kosmetyki
§ korki do butelek od wina
§ osady z oczyszczalni ścieków i inne
b) chemiczna
· sterylizacja gazowa – wykorzystanie gazów do zabicia bakterii. Metoda wykorzystywana do sterylizacji:
o produktów jednorazowego użytku
o sprzętu medycznego
o pościeli szpitalnej i tkanin
o książek
o suszy warzywnych i owocowych
Tlenek etylenu jest trucizną protoplazmatyczną – alkiluje grypy funkcyjne i reszty aminokwasów.
Chlor i ozon służą do dezynfekcji wody.
Wadą tej metody jest jej toksyczność – wymaga zatem szczególnej kontroli i reżimu technologicznego
c) mechaniczna
· sączenie – sączenie płynów, pożywek i buforów przez filtry z porami o średnicy mniejszej niż średnica komórek bakterii (0,2 lub 0,45 μm). Skuteczność tej metody zależy od wielkości bakterii, ich ładunku elektrycznego, budowy powierzchni i powierzchni porów filtra. Stosuje się filtry membranowe z sączkami z nitrocelulozy lub octanu celulozy. Filtry membranowe są także stosowane do:
o oznaczania liczby drobnoustrojów w materiale
o wyjaławiania leków
o &#x...
lenka_997