LABOLATORIUM Z BIOCHEMII

ĆWICZENIE NR 4:

Kwasy nukleinowe

Data wykonania doświadczeń: 31.03.2011r.

Data oddania sprawozdania: 07.04.2011r.

Grupa:

Dominika Kępska  157085

Justyna Dąbrowska

Kierunek: Biotechnologia

Grupa dziekańska: III

Semestr IV

Wstęp teoretyczny

Kwasy nukleinowe- to wielocząsteczkowe polimery nukleotydów. Należą do podstawowych składników komórek zwierzęcych, roślinnych i drobnoustrojów. Wyróżniamy:

·         RNA (kwasy rybonukleinowe- zawierające b-D-rybofuranozę ; występujące głównie w rybosomach)

       b-D-rybofuranoza

·         DNA (kwasy deoksyrybonukleinowe- zawierające 2-deoksy-b-D-rybofuranozę; obecne przede wszystkim w jądrze komórkowym)

         2-deoksy-b-D-rybofuranoza

Nukleotyd- to podstawowa jednostka strukturalna kwasów nukleinowych. Składa się z: zasady azotowej (purynowej lub pirymidynowej)- pełniącej funkcję nośnika informacji genetycznej, składnika cukrowego- pentozy (rybozy lub deoksyrybozy) oraz kwasu ortofosforowego- nadającego charakter kwaśny kwasom nukleinowym i pełniącego funkcję strukturalną.

Zasady azotowe występujące w kwasach nukleinowych to:

Zasady purynowe:

     adenina                                            guanina

Zasady pirymidynowe:

cytozyna                                       uracyl                                                                    tymina

Wolne kwasy nukleinowe mają charakter kwaśny, dzięki czemu dobrze rozpuszczają się w środowisku zasadowym, słabo w wodzie, rozcieńczonych kwasach i alkoholu.

Wykazywanie obecności kwasów nukleinowych opiera się na reakcjach charakterystycznych ich składników, uwolnionych w wyniku hydrolizy pod działaniem mocnych kwasów i podwyższonej temperatury. Do odróżnienia DNA od RNA ( na podstawie składnika cukrowego) służy reakcja Dischego z difenyloaminą.

Część doświadczalna

2.1                          Rozpuszczalność kwasów nukleinowych.

Opis doświadczenia: Do 0,5ml 0,1% roztworów RNA i DNA dodajemy kroplami 1N HCl . Następnie dodajemy roztwór NaOH. Do 1ml 0,1% roztworów DNA i RNA dodajemy 2ml 96% etanolu.

Obserwacje: Po dodaniu kwasu do roztworów RNA i DNA - w obu probówkach- wytrąca się biały osad kwasów nukleinowych. Po dodaniu zasady- w obu probówkach obserwujemy rozpuszczenie się osadu. Po dodaniu etanolu do roztworów RNA i DNA również obserwujemy wytrącenie się białego osadu kwasów nukleinowych w obu probówkach.

Wnioski i zasada: Kwasy nukleinowe mają charakter kwaśny (dzięki obecności kwasu ortofosforowego w nukleotydach) co oznacza, ze są dobrze rozpuszczalne w roztworach zasad, natomiast są słabo rozpuszczalne w wodzie, rozcieńczonych kwasach i alkoholu.

2.2. Kwaśna hydroliza kwasów nukleinowych.

Opis doświadczenia: 2,5ml 1% roztworu kwasów nukleinowych (RNA i DNA w osobnych probówkach) ogrzewamy we wrzącej łaźni wodnej z 2,5ml 10% H­2SO4 w ciągu jednej godziny.

Zasada: Pod wpływem mocnych kwasów mineralnych (H­2SO4) i podwyższonej temperatury(100°C) składniki kwasów nukleinowych zostają uwolnione na drodze hydrolizy. Uzyskujemy wolne zasady purynowe i nukleotydy pirymidynowe. Uzyskane hydrolizaty służą nam do dalszych prób.

2.3. Wykrywanie pentoz w hydrolizatach kwasowych.

2.3.1. Reakcja orcynolowa.

Opis doświadczenia: Do probówek zawierających po 1ml :

1)     hydrolizatu RNA

2)     hydrolizatu DNA

3)     0,1% roztworu RNA

4)     0,1% roztworu DNA

5)     1% roztworu rybozy

6)     1% roztworu deoksyrybozy

dodajemy po 1ml odczynnika orcynolowego, a następnie umieszczamy we wrzącej łaźni wodnej na 15minut. Po upływie tego czasu wyjmujemy probówki z powyższymi roztworami, chłodzimy je, a następnie do każdej próby dodajemy po 5ml wody destylowanej.

Obserwacje: We wszystkich próbach wystąpiło zabarwienie. W każdym przypadku obserwujemy roztwór o innym odcieniu zieleni (od ciemnomorskiego do jasnooliwkowego).

Wnioski: Wszystkie wyżej wymienione roztwory zawierają cukier- pentozę, która zostaje wykryta w wyniku reakcji Biala z orcyną. Na tej podstawie wykrywamy również kwas nukleinowy, w którym zawarty jest składnik cukrowy- pentoza.

Zasada: Pentozy wolne oraz związane w nukleozydach, ogrzewane ze stężonym HCl przechodzą w furfural (cyklizacja pentoz w środowisku kwasowym), który z orcyną i jonami Fe+3 tworzy trwały kompleks o barwie zielonej.

2.3.2. Reakcja Dischego.

Opis doświadczenia: Do probówek zawierających po 1ml:

1) hydrolizatu RNA

2) hydrolizatu DNA

3) 0,1% roztworu RNA

4) 0,1% roztworu DNA

5) 1% roztworu rybozy

6)     1% roztworu deoksyrybozy

dodajemy po 2ml odczynnika difenyloaminowego, a następnie umieszczamy je we wrzącej łaźni wodnej na 10minut.

Obserwacje: W probówkach zawierających: hydrolizat DNA, 0,1% roztwór DNA i 1% roztwór deoksyrybozy pojawia się niebieskie zabarwienie. W pozostałych probówkach znajdują się bezbarwne roztwory.

Wnioski: Niebieskie zabarwienie pojawia się w obecności deoksyrybozy.

Zasada: Powyższa reakcja jest stosowana w celu odróżnienia rybozy od deoksyrybozy. DNA i deoksyryboza wolna oraz związana z zasadą purynową ulegają barwnej reakcji z difenyloaminą.

2.3.3. Wykrywanie kwasu fosforowego.

Opis doświadczenia: 0,5ml hydrolizatu DNA zobojętniamy roztworem amoniaku (dodając 3 krople stężonego roztworu). Następnie dodajemy 0,5ml stężonego roztworu HNO3 i 2ml roztworu molibdenianu amonowego. Zawartość probówki ogrzewamy do wrzenia.

Obserwacje: W probówce zawierającej powyższą mieszaninę wytrącił się żółty osad fosfomolibdenianu amonowego.

Wnioski: Wytrącenie się żółtego osadu fosfomolibdenianu amonowego potwierdza obecność kwasu fosforowego- zawartego w DNA.

Zasada:

2.4. Wykrywanie zasad purynowych.

Opis doświadczenia: Do 1ml hydrolizatu RNA dodajemy 6 kropli stężonego amoniaku i 3ml amoniakalnego roztworu azotanu srebra.

Obserwacje: Obserwujemy wytrącony, szary osad w objętości całego roztworu.

Wnioski: Wytrąconym osadem jest nierozpuszczalny w amoniaku osad soli srebrowych puryn.

Zasada: Stężony amoniak użyty do tej reakcji-tworzy zasadowe środowisko- sprzyjające dobrej rozpuszczalności kwasów nukleinowych, które mogą przereagować z azotanem srebra i utworzyć osad soli srebrowych puryn.

2.5. Oznaczanie zawartości zasad purynowych metodą spektrofotometryczną.

Opis doświadczenia: Na początku przygotowujemy surowiec do pomiaru spektrofotometrycznego. W tym celu do 5g kostki: „Bulion na włoszczyźnie” dodajemy 75ml wody destylowanej i gotujemy we wrzącej łaźni wodnej przez 10minut. Następnie studzimy i przesączamy do kolby miarowej o pojemności 100ml przez gazę młyńską. Uzupełniamy wodą destylowaną do kreski. Po wymieszaniu sączymy roztwór przez sączek bibułowy. Badany roztwór rozcieńczamy roztworem  0,1N HCl, dodając do 0,5ml tego roztworu 9,5ml kwasu. W tak przygotowanym roztworze oznaczamy zawartość zasad purynowych dokonując pomiaru absorbancji przy następujących długościach fali: 262nm i 290nm dla adeniny oraz 249nm i 290nm dla guaniny. Są to maksymalne wartości pochłaniania i 290nm.

Wyniki absorbancji (dla poszczególnych kostek bulionowych):