Badania immunologiczne

              Zgodnie z założeniami projektu dokonano oceny następujących parametrów immunologicznych u dzieci z XLA i CVID:

a)                              charakterystykę fenotypu limfocytów i monocytów krwi obwodowej,

b)                              zdolność limfocytów T krwi obwodowej do proliferacji (po stymulacji  przeciwcialami anty-CD3 i PHA)

c)                              poziom syntezy cytokin w hodowlach limfocytów indukowanych przeciwciałami anty-CD3.

Badania fenotypu limfocytów obejmowały określenie ekspresji następujących receptorów błonowych:

1)                              limfocytów T (CD3, CD4, CD8, CD28), komórek NK (CD56) oraz  limfocytów B (CD19),

2)                              izoform powszechnego antygenu leukocytarnego (CD45Ag), tj. CD45RA, CD45RO oraz CD45RB w populacjach limfocytów T CD4+ oraz T CD8+ ,

3)                              koekspresji receptora CD27 z izoformami CD45RA i CD45RO w populacjach komórek T CD4+ i CD8+

4)                              koekspresji receptora CD27 i CD28 w populacjach  limfocytów T CD4+ i CD8+    

Badania fenotypu monocytów krwi obwodowej obejmowały ocenę ekspresji niektórych receptorów o funkcji kostymulacyjnej oraz efektorowej i dotyczyły receptorów CD11a, CD86, HLA-DR, CD54, CD14 oraz CD16.

Ekspresję receptorów błonowych limfocytów i monocytów określano techniką cytometrii przepływowej przy użyciu cytometru firmy Coulter, typu EPICS XL-MCL oraz (w niektórych badaniach), a  także cytometru typu FASC-scan firmy Becton-Dickinson.  Określano % komórek pozytywnych dla każdego markera błonowego oraz intensywność fluorescencji  (FI), mierzoną jako tzw „mean channnel number”.

Barwień przy użyciu swoistych przeciwciał monoklonalnych (sprzężonych z fluoresceiną-FITC fikoerytryną –PE oraz PerCp dokonywano w populacji jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) izolowanych na gradiencie gęstości (Lymphoprep, Nycomed, Oslo, Norwegia) wg. procedur uprzednio opisanych i opublikowanych (1-4).

Test proliferacji limfocytów przy użyciu przeciwciał anty-CD3 (Sigma) oraz PHA (Sigma) przeprowadzano w trzydniowych hodowlach, w mikropłytkach hodowlanych, w medium hodowlanym (RPMi-1640 + 5% inaktywowanej surowicy ludzkiej).  Wyniki podano w imp/mi (4,5).

Poziom syntezy cytokin (IFN-gamma, TNF-alfa, IL-10, IL-12, IL-6 oraz IL-13) określano po 48 godzinach aktywacji PBMC ( 1 x 106 /ml) z przeciwciałami anty-CD3 (100 ng/ml). Po zakończeniu inkubacji komórki wirowano, supernatant zachowywano i określano poziom cytokin technika immunoenzymatyczną ELISA, przy uzyciu fabrycznie przygotowanych zestawów (firmy Becton-Dickinson), wg. procedur uprzednio opisanych (6).

II a Omówienie wyników

Wyniki badań immunologicznych przedstawiono w tabelach od 1-12. Generalnie wskazują one zaburzenia zarówno w zakresie ekspresji markerów błonowych limfocytów  i monocytów jak i defekt w zakresie  niektórych parametrów czynnościowych, szczególnie u chorych z CVID.

Tabela  1. Charakterystyka fenotypowa podstawowych subpopulacji limfocytów u dzieci z  CVID oraz XLA