podłoża mikrobiologiczne.doc

MIKROBIOLOGIA – NOTATKI

1.       PODŁOŻA MIKROBIOLOGICZNE.

Podłoże mikrobiologiczne to sztucznie stworzone środowisko wzrostu do hodowli drobnoustrojów.

Są stosowane w stosunku do drobnoustrojów do:

·         izolacji

·         różnicowania

·         identyfikacji

·         namnażania

·         określania właściwości fizjologicznych, biochemicznych i hodowlanych

·         otrzymywania produktów metabolizmu

Cechy podłoży do hodowli drobnoustrojów:

·         zawierają łatwo dostępne źródła pierwiastków biogennych (C, O, H, N, P, S), energii i soli mineralnych

·         odpowiednie pH i potencjał redox

·         przejrzystość (z wyjątkiem podłoży zawierających związki nierozpuszczalne np. tłuszcze czy CaCO3)

·         odpowiednie ciśnienie osmotyczne

·         jałowość

Podziały podłoży:

Zasadniczo można podzielić podłoża na zwykłe (podstawowe), jak bulion, woda peptonowa czy brzeczka, służące do hodowli drobnoustrojów i do przygotowywania podłoży drugiego typu – podłoży specjalnych, które służą do izolacji i identyfikacji drobnoustrojów.

Podłoża można też dzielić:

a)      ze względu na zawartość składników odżywczych

·         minimalne – zawierają tylko składniki pokarmowe służące do podtrzymania wzrostu drobnoustrojów (np. podłoże M9)

·         pełne – zawierają wszystkie niezbędne substancje odżywcze umożliwiające dobry wzrost drobnoustrojów (źródło węgla, azotu, sole mineralne i czynniki wzrostowe). Jest to np. bulion do hodowli bakterii lub brzeczka do hodowli drożdży

·         wzbogacone – są sporządzane dla drobnoustrojów słabo rosnących in vitro, które w tych warunkach wymagają do wzrostu dodatkowych substancji odżywczych

b)      ze względu na skład chemiczny

·         naturalne – podłoża o nie w pełni znanym składzie chemicznym, jak np. bulion, brzeczka, mleko. Są to podłoża pełne.

·         półsyntetyczne – podłoża o częściowo znanym składzie, np. podłoże M9 wg Adamsa wzbogacone glukozą i autolizatem drożdży służące do hodowli bakterii Proteus i Escherichia. Mogą to być podłoża minimalne, pełne lub wzbogacone.

·         syntetyczne – podłoża o w pełni określonym składzie, np. podłoże z mannitolem do hodowli Azotobacter. Mogą to być podłoża minimalne, pełne lub wzbogacone.

c)       ze względu na konsystencję

·         stałe – zawierają 1,5-2% agaru; służą do namnażania i (głównie) do różnicowania bakterii

·         półpłynne – zawierają 0,1-0,7% agaru; służą np. do badania ruchu bakterii

·         płynne – bez agaru; służą do namnażania drobnoustrojów

d)      ze względu na przeznaczenie i zastosowanie

·         namnażające – służą do otrzymywania dużej biomasy określonych szczepów. Zwykle płynne

·         wybiórcze – z dodatkiem związku(ów) hamującego wzrost konkretnej grupy drobnoustrojów

·         namnażająco-wybiórcze – pozwalają na namnożenie się tylko jednego gatunku lub jednej grupy mikroorganizmów, znajdujących się w posiewanym materiale. Zawierają związki hamujące wzrost jednej grupy mikroorganizmów, a ułatwiające wzrost innej. Przykłady:

o        podłoże bezazotowe z mannitolem do hodowli bakterii wiążących N2 z atmosfery

o        podłoże z kwaśnym selenianem sodu do hodowli E. coli i do namnażania Salmonella sp. z kału lub próbek żywności

o        podłoże Kauffmana z czterotionianem sodu i żółcią – hamuje wzrost bakterii kałowych, oprócz Salmonella sp.

·         izolacyjne – podłoża stałe zawierające związek (identyfikator) pozwalający odróżnić od siebie kolonie bakterii. Przykłady:

o        płytka Endo z laktozą do diagnozy Enterobacteriaceae

o        podłoże Chapmana z mannitolem do hodowli gronkowców

o        podłoże Clauberga z tellurynem potasu do hodowli Corynebacterium sp.

·         identyfikacyjne – podłoża do badania właściwości biochemicznych bakterii

·         transportowe – podłoża do zabezpieczania materiału na czas przenoszenia od pacjenta do laboratorium, będące zwykle zbuforowanymi podłożami minimalnymi, bez składników odżywczych – tylko z solami mineralnymi.

2.       STERYLIZACJA

Sterylizacja (wyjaławianie) to proces zabijania drobnoustrojów zarówno w formie wegetatywnej i przetrwalnej.

Zastosowanie sterylizacji:

·         w placówkach medycznych

·         przy produkcji leków,

·         przy produkcji płynów infuzyjnych, preparatów krwiopodobnych i protez

·         przy produkcji materiałów opatrunkowych

Metody sterylizacji

a)      fizyczna

·         wysoką temperaturą (sterylizacja cieplna)

o        sucha

§  wyjaławianie przez wyżarzanie – spalanie drobnoustrojów w płomieniu palnika; do wyjaławianie ezy i igieł preparacyjnych przed i po szczepieniu pożywki. Trzeba rozgrzać do czerwoności

§  wyjaławianie przez opalanie – opalanie w płomieniu palnika brzegów kolb i probówek oraz bagietek, głaszczek szklanych, szkiełek podstawowych do preparatów mikroskopowych. Ponadto skalpele, łopatki metalowe, pensety, grube igły sterylizuje się przez zanurzenie w etanolu i opalenie w płomieniu palnika.

§  wyjaławianie gorącym suchym powietrzem – przeprowadza się w suszarkach:

°          w 140°C przez 2,5 h

°          w 160°C przez 2 h

°          w 180°C przez 1 h

Służy do wyjaławiania szkła laboratoryjnego, materiałów trwałych, przedmiotów stalowych, materiałów sypkich itp.

Przygotowanie szkła do steryzlizacji tą metodą:

°          probówki zakrywa się korkami z waty, ligniny lub metalowymi

°          kolby zakrywa się korkami z ligniny lub „kołderkami” i kawałkami folii aluminiowej

°          płytki Petrieo i pipety zawija się w papier lub umieszca się w metalowych tubusach (ustniki pipet zabezpiecza się dodatkowo wacikami)

o        mokra (parą wodną)

§  dekoktacja (wyjaławianie przez gotowanie) – niegdyś używana na większą skalę do sterylizacji instrumentów chirurgicznych i zabiegowych, dziś powinna być ograniczona jedynie do wyjątkowych sytuacji i przy użyciu wody destylowanej. Nie eliminuje wirusów zapalenia wątroby i przetrwalników bakterii.

§  pasteryzacja – działanie wysokiej temperatury poniżej 100°C. Niszczy formy wegetatywne drobnoustrojów obecnych w środowisku płynnym (np. mleko, piwo, soki itp). Ma na celu zniszczenie drobnoustrojów chorobotwórczych i przedłużenie ważności produktów spożywczych. Wyróżnia się:

°          pasteryzację niską (długotrwałą) – ogrzewanie w temperaturze 63-65°C przez 0,5 h

°          pasteryzację wysoką (szybką) – ogrzewanie w temperaturze 72°C przez 15 s (płyn przepływa cienką warstwą przez specjalny aparat) lub 90°C (wtedy bez zatrzymywania w aparacie)

°          obróbkę termiczną UHT (Ultra High Temperature) stosującą dwie metody:

v      pasteryzację szybką HTST (High Temperature Short Time)

v      pasteryzację ultraszybką – ogrzewanie mleka (przepływającego cienką warstwą w aparacie) w temperaturze 130-150°C

Otrzymywanie mleka zupełnie jałowego z inaktywowanymi wirusami pryszczycy. Mleko poddawane metodzie UHT musi być czyste mikrobiologicznie i pozbawione enzymów bakteryjnych. Jej wadami są gorzknienie mleka, koagulacja jego białek i częściowy rozkład.

Każda metoda pasteryzacji kończy się gwałtownych schłodzeniem produktu, tak aby nie stracił wartości odżywczych

§  tyndalizacja – proces trzykrotnej sterylizacji w odstępach 24-godzinnych. Przeprowadza się ją w aparacie Kocha i polega na działaniu gorącej pary wodnej. Przebieg sterylizacji:

1)      ogrzewanie w temperaturze 100°C  przez 0,5 h

2)      inkubacja podłoża w cieplarce w temperaturze 32°C na 24 h (wykiełkowanie przetrwalników)

3)      drugie ogrzewanie w temperaturze 100°C  przez 0,5 h (zabicie wykiełkowanych form)

4)      inkubacja podłoża w cieplarce w temperaturze 32°C na 24 h (wykiełkowanie potencjalnych przetrwalników, które przeżyły)

5)      trzecie ogrzewanie w temperaturze 100°C  przez 0,5 h

Pojedyncza sterylizacja w temperaturze 100°C przez 0,5 h nie niszczy przetrwalników.

§  wyjaławianie za pomocą pary wodnej pod zwiększonym ciśnieniem – sterylizacja wysoką temperaturą uzyskaną po sprężeniu nasyconej pary wodnej w odpowietrzonym autoklawie. Metoda używana w stosunku do produktów, które nie ulegają rozkładowi w temperaturze powyżej 100°C. Polega na uwalnianiu ciepła kondensacji podczas skraplania pary wodnej na chłodniejszych przedmiotach (dlatego potrzebne jest odpowietrzenie – w jego obecności skropleniu towarzyszy obniżanie temperatury). Używa się nadciśnienia 0,8-1,6 atm, co odpowiada 177-127°C.

Do sterylizacji drobnych narzędzi (np. w aptekach, laboratoriach itp.) używa się szybkowarów.

Procesowi wyjaławiania podlegają produkty zawierające całe populacje drobnoustrojów (a nie pojedyncze komórki).

Czas śmierci cieplnej – czas potrzebny do zabicia wszystkich drobnoustrojów tego samego gatunku przy określonej temperaturze i składzie pożywki.
Punkt śmierci cieplnej – temperatura, która zabija hodowlę bakteryjną w ciągu 10 minut.

·         promieniowanie

o        za pomocą promieni UV – promieniowanie UV o zakresie fal 230-270 nm wykazuje silne działanie bakteriobójcze lub mutagenne. Szczególnie promieniowanie o długości fali 260 nm jest pochłaniane przez zasady azotowe DNA i aminokwasy aromatyczne białek, z tym, że najbardziej wrażliwe są formy wegetatywne (szczególnie w fazie logarytmicznego wzrostu). Promieniowanie powoduje powstawanie dimerów T, C oraz T z C tej samej nici DNA, co prowadzi do zaburzeń replikacji. Bakterie mogą się chronić przed mutagennym działaniem promieni UV przez:

§  fotoreaktywację – rozszczepianie dimerów T przez fotolizazy

§  reperację ciemną – wycięcie uszkodzonego DNA i zastąpienie go prawidłowym

Promieniowanie UV jest stosowane także do sterylizacji pomieszczeń. Działa powierzchniowo.

o        sterylizacja radiacyjna – niszczenie drobnoustrojów za pomocą promieniowania jonizującego, głównie promieni X i γ w dawce 1-3 megaradów. Niszczy ono bakterie prawdopodobnie przez destrukcję struktury DNA i radiolizę wody. Jako źródło promieniowania wykorzystuje się izotopy (głównie kobalt 60) i akceleratory elektronów. Tą metodą można sterylizować:

§  sprzęt medyczny

§  protezy biologiczne

§  katgut

§  materiały opatrunkowe

§  leki i farmaceutyki

§  produkty spożywcze (suche)

§  kosmetyki

§  korki do butelek od wina

§  osady z oczyszczalni ścieków i inne

b)      chemiczna

·         sterylizacja gazowa – wykorzystanie gazów do zabicia bakterii. Metoda wykorzystywana do sterylizacji:

o        produktów jednorazowego użytku

o        sprzętu medycznego

o        pościeli szpitalnej i tkanin

o        książek

o        suszy warzywnych i owocowych

Tlenek etylenu jest trucizną protoplazmatyczną – alkiluje grypy funkcyjne i reszty aminokwasów.

Chlor i ozon służą do dezynfekcji wody.

Wadą tej metody jest jej toksyczność – wymaga zatem szczególnej kontroli i reżimu technologicznego

c)       mechaniczna

·         sączenie – sączenie płynów, pożywek i buforów przez filtry z porami o średnicy mniejszej niż średnica komórek bakterii (0,2 lub 0,45 μm). Skuteczność tej metody zależy od wielkości bakterii, ich ładunku elektrycznego, budowy powierzchni i powierzchni porów filtra. Stosuje się filtry membranowe z sączkami z nitrocelulozy lub octanu celulozy. Filtry membranowe są także stosowane do:

o        oznaczania liczby drobnoustrojów w materiale

o        wyjaławiania leków

o     &#x...