prelekcja3b.doc

Systemy leczenia i dostarczania leków

Defekty w schorzeniach warunkowanych genetycznie dotyczą pojedynczego genu (np. hemofilie A i B, anemia sierpowata, fenyloketonuria, mukowiscydoza, dystrofia mięśniowa Duchena i inne) lub wielu genów jednocześnie (np. nowotwory, miażdżyca, reumatyzm, choroby degradacyjne układu nerwowego). Leczenie tych chorób ograniczało się dotąd do łagodzenia objawów klinicznych bez możliwości leczenia przyczynowego. Postęp w biologii molekularnej i biotechnologii stworzył nowe możliwości leczenia chorób warunkowanych genetycznie poprzez naprawę, zamianę lub zablokowanie funkcji genu odpowiedzialnego za wystąpienie danej jednostki chorobowej.

Podstawą tej metody jest wprowadzenie do zmienionych chorobowo komórek fragmentu DNA zastępującego, własny, zdefektowany gen i przywracając prawidłową funkcję komórek, tkanek czy narządów lub poprzez selektywne blokowanie ekspresji i translacji odpowiednich genów.

Terapia genowa może dotyczyć komórek rozrodczych, zygoty lub komórek somatycznych. Terapia germinatywna, na komórkach rozrodczych człowieka, ze względu na nieprzewidywalność skutków u potomstwa i ze względów etycznych jest zabroniona. Terapia genowa na komórkach somatycznych może korygować defekty nie tylko genetyczne, ale również nabyte takie jak np. AIDS, nowotwory, choroby układu krążenia.

Geny terapeutyczne wprowadzane są do komórek somatycznych in vitro, a następnie dokonywane są próby wprowadzania ich do komórek metodą ex vivo lub in vivo.
Metoda ex vivo polega na pobraniu komórek pacjenta, ich hodowli in vitro, wprowadzeniu terapeutycznego genu, a następnie ponownym wszczepieniu transfekowanych komórek do organizmu pacjenta. Skuteczność tej metody zależy od aktywności wprowadzonego genu tj. jego transkrypcji w dostatecznym natężeniu i wystarczająco długim działaniu, aby zapewnić efekt terapeutyczny (ryc.1).

Metoda in vivo polega na bezpośrednim wprowadzeniu terapeutycznego genu do organizmu pacjenta za pośrednictwem odpowiedniego wektora mając nadzieję, że dojdzie do transfekcji w komórkach wewnątrz organizmu i odpowiedniej ekspresji genu (ryc.2).

Metoda genoterapii ex vivo jest wygodniejsza, ponieważ można wybrać odpowiedni typ komórek i wprowadzić do nich gen terapeutyczny w odpowiednie miejsce w genomie metodą rekombinacji homologicznej (proces zachodzący między identycznymi odcinkami lub całymi genami ). Wektory stosowane w tej metodzie zawierają dodatkowo gen oporności na antybiotyk, np. neomycynę, umożliwiający selekcję transfekowanych komórek.

Do terapii in vivo najlepiej nadają się przypadki enzymopatii, warunkowane mutacjami pojedynczych genów kodujących określone enzymy.

Terapia genowa jest skuteczna, gdy następuje ekspresja wprowadzonego genu, czyli w wyniku jego transkrypcji i translacji powstaje białko dające efekt terapeutyczny.

Wśród konstruowanych nośników wyróżniamy:

1)   wektory wirusowe
2)   liposomy
3)   wektory niewirusowe

Wektory wirusowe. (rys.3) Wirusy używane do konstrukcji wektorów do terapii genowej to: retrowirusy, adenowirusy, wirusy adenosatelitarne (AAV), herpes wirusy typu I (Herpes Simplex Virus) oraz wirusy defektywne (pozbawione zdolności namnażania i infekowania).

 Najczęściej wykorzystywane są retrowirusy i adenowirusy ,ponieważ mają zdolność wbudowywania obcego DNA do genomu komórek dzięki czemu ekspresja przenoszonych genów terapeutycznych może być długotrwała (rys.4).

Retrowirusy infekują wyłącznie dzielące się komórki. Retrowirusy są zazwyczaj czynnikami patogennymi i onkogennymi, powodujacymi przekształcenie zdrowej komórki w komórkę nowotworową. Wirus HIV, wywołujący AIDS należy do podgrupy retrowirusów zwanej lentiwirusami. Niektóre retrowirusy są odpowiedzialne za ciężkie choroby neurodegradacyjne. Stąd wybór wirusa do wytworzenia z niego wektora do genoterapii musi być bardzo staranny.

Wektory retrowirusowe używane najczęściej w genoterapii to pochodne silnie transformujących szczepów wirusa leukemii mysiej (Moloney Murine Leukemia Virus- Mo-HLV).Wektory te są jednak szybko inaktywowane we krwi ludzkiej przez układ dopełniacza.

Z tego powodu transfer retrowirusowy może być skuteczny in vivo jedynie lokalnie np. iniekcja wprost do guza nowotworowego, wlew dokanałowy. Obecnie przeszkodę tę można ominąć dzięki użyciu przeciwciał monoklonalnych dla któregoś z elementów dopełniacza (C1,C2........C9).

Retrowirusy mogą przenosić geny do 5 kb (5000 par zasad) i charakteryzują się zdolnością infekcji dużego spektrum komórek (rys.5).

Adenowirusy mają zdolność infekowania komórek dzielących się i nie dzielących się oraz uzyskiwania dużej liczby wirionów z jednej komórki( zaleta hodowli in vitro ) Wykazują jednak znaczną immunogenność, a odpowiedź immunologiczna dotyczy wolnych wirionów i transfekowanych komórek. Zaletą adenowirusów jest to, że mogą pomieścić cząsteczkę DNA o wielkości do 8 kb, są więc drugimi po retrowirusach wektorami używanymi w genoterapii (rys.6).

Niektóre parwowirusy tzw. wirusy stowarzyszone z adenowirusami (AAV) nie wywołują odpowiedzi układu odpornościowego, ale istnieją trudności w otrzymaniu ich w wysokim mianie w hodowli in vitro. Zrekombinowane wirusy AAV nie integrują się z genomem komórki i pozostają w formie episomalnej, tj. występują w cytoplazmie i ich ekspresja jest krótkotrwała ze względu na degradację przez nukleazy lub usuwanie ich z komórki.

Wektory skonstruowane w oparciu o wirusa opryszczki (HSV) są zdolne do penetracji komórek nie dzielących się i do przenoszenia dużych fragmentów egzogennego DNA, ale wywołują efekt cytotoksyczny.

Jednym ze sposobów uniknięcia patogeniczności wirusów jest konstrukcja wirusów defektywnych, które nie mogą namnażać się i infekować komórek. Mogą jednak spełniać tę rolę przez równoczesne wprowadzenie wirusów pomocniczych, które nie są patogenne. Do konstrukcji wirusów defektywnych używa się komórek pomocniczych tzw. enkapsydacji, w których wektor wirusowy uzyskuje otoczkę konieczną do wniknięcia do komórki (rys.6).

Konstrukcja uniwersalnego wektora wirusowego, pozbawionego wad jest bardzo trudna. Poszukuje się zatem innych, niewirusowych wektorów.

Liposomy są to cząsteczki lipidów zawierających DNA. Ten typ wektora łatwo wnika do komórek dzięki lipofilności błon, transportując do wnętrza komórki egzogenny DNA. Używane są lipidy kationowe które ułatwiają wniknięcie materiału genetycznego do komórek hodowanych in vitro jak również są one przydatne w transfekcji komórek in vivo (chronią DNA przed degradacją enzymatyczną). Poprzez modyfikowanie ich wielkości, ładunku lub dodanie swoistych ligandównmożna uzyskać specyficzność kontaktu liposomów z różnymi typami komórek. Stymulują one również endocytozę cząsteczek DNA i jego wewnątrzkomórkowe uwalnianie (rys.7).

Kationowe lipidy znalazły zastosowanie w pierwszych próbach klinicznych wprowadzania genów terapeutycznych do komórek chorych tkanek.

Wprowadzane są one do komórek nabłonka oddechowego w formie aerozolu podawanego donosowo lub za pomocą bronchoskopu w genoterapii mukowiscydozy.

Mukowiscydoza jest chorobą autosomalną recesywną spowodowaną mutacją genu kodującego białko błon komórkowych, zwane regulatorem przewodzenia przezbłonowego(CFTR).

W wyniku mutacji zaburzony jest transport chlorków z komórki na zewnątrz w nabłonkach wyścielających drzewo oskrzelowe, jelita, przewody wydzielnicze trzustki i przewody żółciowe. Doprowadza to do nadmiernego zagęszczenia śluzu, który nie może być usunięty z drzewa oskrzelowego, zalega w płucach i jest przyczyną ciężkich, uporczywych zakażeń. Powoduje również upośledzenie funkcji wydzielniczych oraz zaburzenia wchłaniania jelitowego.

Podanie genu CFTR z wektorem liposomowym daje skuteczny, ale krótkotrwały efekt terapeutyczny.

Wektory niewirusowe. Metoda wprowadzenia DNA do komórek przy użyciu wektorów zwanych koniugatami molekularnymi lub polipleksami białko/DNA oparta jest na wykorzystaniu endocytozy kierowanej receptorami, która jest wysoce specyficznym i selektywnym procesem transportu substancji zewnątrzkomórkowych do cytoplazmy z udziałem błony komórkowej. Komórki ssaków mają właściwe sobie receptory powierzchniowe, które umożliwiają wiązanie i pobieranie na drodze endocytozy różnych ligandów (tabela 1).

Niektóre typy komórek wykazują na swojej powierzchni znacznie większą ekspresję specyficznych receptorów dla określonych cząsteczek biologicznych (białek, peptydów, wielocukrów) niż inne komórki tego samego organizmu, narządu czy tkanki. Znajomość ligandów dla receptorów powierzchniowych, specyficznych dla określonego typu komórek ssaków została wykorzystana do konstrukcji wektorów dla selektywnego wprowadzania DNA do wybranych komórek docelowych.

Wektory te, zwane koniugatami molekularnymi, składają się z ligandu połączonego kowalencyjnie z białkiem lub peptydem, z którym dzięki oddziaływaniom elektrostatycznym związany jest terapeutyczny DNA. Złożone są one zazwyczaj z 4 domen: 1- domena, która wiąże wprowadzony DNA, 2-ligand, który specyficznie wiąże się z odpowiednim receptorem na błonie komórki docelowej, 3-czynnik lizujący, który umożliwia uwolnienie wektora z endosomu (pęcherzyka transportującego), 4-domena ułatwiająca wprowadzenie genu do jądra komórkowego (rys.8).

W koniugatach molekularnych odpowiednio dobrany gen terapeutyczny, który ma być wprowadzony do komórki docelowej, musi zostać połączony z domeną wiążącą w taki sposób, aby nie uszkodzić struktury wprowadzonego genu i umożliwić skonstruowanie wektora o jak najkorzystniejszych parametrach dla pobrania go przez komórkę na drodze endocytozy (rys.9).

Najpowszechniej stosowanym do wiązania DNA czynnikiem jest poli-L-lizyna (PLL), polikation złożony z powtarzających się reszt lizyny o długości cząsteczki od 15 do około 1000 reszt lizynowych. Podczas reakcji wiązania zachodzi zmiana konformacji cząsteczki DNA na strukturę pierścieniową. Powstające struktury mają średnicę 80-100 nm, co umożliwia ich pobieranie na drodze endocytozy przez większość komórek ssaków.

Innymi wiążącymi domenami są syntetyczne polimery mające zdolność do tworzenia z DNA skondensowanych kompleksów.
Naturalnymi białkami stosowanymi do wiązania DNA w koniugatach molekularnych są spermina i spermidyna oraz histony, białka, które nie tylko upakowują DNA ale ułatwiają wnikanie wektorów do jądra komórkowego.

Często stosowanym naturalnym ligandem wbudowywanym do koniugatów jest transferyna. Wiele komórek nowotworowych wykazuje na błonie komórkowej silną ekspresję receptorów folianowych dlatego polikompleksy kwas foliowy/polikation/DNA dają możliwość ukierunkowanego wprowadzania genów do komórek nowotworowych i zastosowania tych wektorów w terapii genowej nowotworów nerek, jelita, pęcherza moczowego, jajnika, mózgu, płuc.

Wyniki przeprowadzonych w ostatnich latach badań wskazują, że koniugaty molekularne mogą stać się bardziej uniwersalnymi wektorami niż wirusowe.
Wektory te wykazują największą specyficzność przenoszenia genów terapeutycznych lub oligonukleotydów do wielu typów komórek, umożliwiając ich wprowadzenie do komórek in vitro i in vivo . Mogą być stosowane zarówno w przenoszeniu genów do komórek proliferujących jak i nie dzielących się. Wektory wirusowe stwarzają ryzyko mutacji wirusowego genomu prowadzących do efektów toksycznych, aktywacji lub inaktywacji genów funkcjonalnych w komórkach biorcy.Takie ryzyko nie występuje przy użyciu wektorów niewirusowych.

Obecnie stosowane polipleksy mają dwa główne ograniczenia: (1)stosunkowo niską wydajność transferu genów i (2) często krótkotrwałą ekspresję wprowadzonych genów.
Zaletą ich jest potencjalne bezpieczeństwo oraz znacznie większa niż innych wektorów kierunkowość genów terapeutycznych.

Wektory przyszłości powinny cechować się wysoką pojemnością, wydajnością i selektywnością. Powinny zapewniać właściwą integrację genu terapeutycznego z genomem komórki biorcy oraz działać bez skutków ubocznych.

 Genoterapia z zastosowaniem antysensowych oligonukleotydów

Syntetyczne oligonukleotydy komplementarne (antysensowne) wobec fragmentów DNA lub RNA mogą z nimi hybrydyzować, hamując ekspresję genów odpowiednich białek. Antysensowe oligonukleotydy (5-20 nukleotydowe) są oporne na działanie nukleaz tylko wówczas, gdy zawierają elementy struktury zmodyfikowane w stosunku do naturalnego DNA. Najbardziej bezpieczna wydaje się modyfikacja grupy fosforanowej polegająca na zamianie jednego atomu tlenu na atom siarki lub grupę metylową. Tak zmodyfikowane oligonukleotydy określane są odpowiednio, jako tiofosforanowe lub metylofosfonianowe analogi DNA (rys.10).

Tiofosforanowe oligonukleotydy, podobnie jak naturalne fragmenty DNA, mogą hybrydyzować z komplementarnymi fragmentami RNA i tworzyć dwuniciowe struktury mRNA-DNA. Kompleksy takie są rozpoznawane jako substraty przez RNazę H, która degraduje związany fragment mRNA i uniemożliwia jego udział w syntezie odpowiednich białek.

Oligonukleotydy tiofosforanowe mogą również hybrydyzować z komplementarnymi fragmentami DNA i tworzenie trójniciowych form – tripleksów DNA. Struktury takie mogą zahamować ekspresję wybranych genów już na etapie transkrypcji (rys.11).

Najbardziej zaawansowane są badania nad oligonukleotydami antysensowymi wobec mRNA i kilka z nich jest już na etapie badań klinicznych. Dwa z nich hamują replikację wirusów (wirusa cytomegalii i wirusa HIV). Kolejne oligonukleotydy wykazują aktywność antysensową wobec mRNA kinazy białkowej C oraz onkogenów c-myb oraz c-raf. Białkowe produkty tych genów są związane z etiologią chorób nowotworowych m.in. ostrej i przewlekłej białaczki.

W II fazie badań klinicznych znajduje się oligonukleotyd, który hamuje ekspresję białka ICAM-1 (intracellular adhesion molecule) odpowiedzialnego m.in. za adhezję komórek.
Istnieje szansa, że będzie on stosowany w terapii reumatoidalnego zapalenia stawów, łuszczycy, zapalenia okrężnicy i chorobie Crohna.

Szczepionki DNA

Transfer genów może mieć zastosowanie nie tylko w przywracaniu prawidłowych funkcji komórek, ale także w nadawaniu im zupełnie nowych właściwości np. odporności na infekcje wirusowe lub bakteryjne.
Produkt wprowadzonego obcego genu jest rozpoznawany przez komórki układu immunologicznego i indukuje odpowiedź immunologiczną.

Dostarczanie DNA kodującego białka antygenów wirusowych lub bakteryjnych w celu ochrony organizmu przed infekcją oparte na immunizacji plazmidowym DNA nosi nazwę szczepionki genetycznej lub szczepionki DNA.

Szczepionki DNA nie zawierają patogenów, adjuwantów (wzmacniaczy), wektorów replikacyjnych i powinny być bezpieczniejsze niż preparaty zawierające atenuowane szczepy.
Odpowiedź immunologiczna może być indukowana przez wstrzyknięcie DNA rozpuszczonego w roztworze soli fizjologicznej, DNA skompleksowanego z lipidami lub przez dostarczenie materiału genetycznego w postaci mikroskopijnych kulek złota opłaszczonych DNA, a także w postaci aerozolu bądź kropli do nosa.

Najszerzej stosowaną metodą jest obecnie bezpośrednia injekcja DNA rozpuszczonego w roztworze soli fizjologicznej ( tzw. „nagiego” DNA) do mięśni szkieletowych lub śródskórnie. Wynikiem tego jest wzbudzenie specyficznej odpowiedzi immunologicznej i długotrwała ochrona. Inną ważną zaletą szczepionek DNA jest możliwość wywoływania odporności przeciwko różnym szczepom tego samego wirusa czy bakterii.

Obecnie trwają badania nad skuteczną szczepionką przeciw wirusowi HIV. Przeprowadzono szereg doświadczeń z wykorzystaniem DNA kodującego różne fragmenty białka wirusa HIV np. białka otoczki (gp120 i jej prekursor gp160) oraz białka regulatorowe (Rev, Nef). Stosując różne modele zwierzęce, wykazano, że szczepionki genetyczne indukują powstanie zarówno swoistych cytotoksycznych limfocytów T, jak i ochronnej odpowiedzi immunologicznej, zależnej od neutralizujących przeciwciał klasy IgG.

Terapia genowa budzi największe nadzieje w leczeniu chorób nowotworowych. Szczepionki genetyczne dają bowiem możliwość wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciw nowotworowi. Jedną z takich strategii jest podawanie komórkom nowotworowym genu kodującego silnie immunizujący antygen allogeniczny układu głównych antygenów zgodności tkankowej (MHC). Antygeny nowotworowe nierozpoznawalne wcześniej przez układ odpornościowy mogą dawać silną odpowiedź immunologiczną i zwalczenie nowotworu przez organizm.

Innym przykładem zastosowania szczepionek genetycznych jest wykorzystanie DNA kodującego białkowe produkty onkogenów w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej przeciw tym białkom, np. terapia raka piersi poprzez domięśniową lub śródskórną injekcję DNA onkogenu neu, którego produktem jest białko p185.

Mimo, że szczepionki DNA, w porównaniu z konwencjonalnymi metodami leczenia nowotworów (leczenie chirurgiczne, chemioterapia, radioterapia), jeszcze długo nie będą terapią wiodącą, ale mogą przyczynić się do ograniczenia objawów ubocznych obserwowanych w terapii prowadzonej metodami standardowymi.

Geny samobójcze to geny indukujące fenotyp toksyczny. Kodują one białka zwiększające toksyczność niektórych chemioterapeutyków. Komórki nowotworowe transfekowane takimi genami ulegają zniszczeniu. Najczęściej stosowany jest gen kinazy tymidynowej wirusa Herpes simplex kodujący białko enzymatyczne, które jest również zdolne do fosforylacji analogów nukleotydów np. gancyklowiru lub acyklowiru. Pod wpływem enzymów komórki biorcy (w tym przypadku nowotworowej) związki te ulegają dalszej fosforylacji do silnie toksycznych trifosforanów. Zniszczeniu ulegają w ten sposób nie tylko transfekowane komórki nowotworowe, lecz również kontaktujące się z nimi komórki, które uniknęły transfekcji (efekt „bystander”). Można w ten sposób znacznie lub całkowicie zniszczyć guz nowotworowy.

Wprowadzenie do komórek nowotworowych genu interleukiny 6 i genu jej rozpuszczalnego receptora zwiększa ich immunogenność i tym samym przyczynia się do skutecznego niszczenia nowotworu przez układ odpornościowy.

Wszystkie omówione metody terapii genowej są nadal na etapie badań doświadczalnych na zwierzętach i tylko niektóre z nich weszły w fazę badań klinicznych na ludziach.

Pierwsza kliniczna próba terapii genowej została przeprowadzona w 1990 r w USA u 4-letniej dziewczynki z ciężkim niedoborem odporności (SCID–severe combined immunodeficiency ) spowodowanym wrodzonym brakiem deaminazy adenozyny – zespół ADA. Choroba ujawnia się jako ciężki brak odporności prowadzący do śmierci w wieku niemowlęcym lub dziecięcym z powodu infekcji.

Zastosowano metodę ex vivo do wprowadzenia genu deaminazy adenozyny do limfocytów T produkujących enzym. Uzyskano znaczną poprawę stanu klinicznego, ale terapię trzeba było powtarzać ze względu na ograniczony czas życia zmodyfikowanych limfocytów T.

Kolejne próby dotyczyły wprowadzenia terapeutycznego genu do komórek macierzystych szpiku kostnego. Dawało to szansę ekspresji genu we wszystkich komórkach krwi włącznie z limfocytami produkującymi enzym. W jednym przypadku stwierdzono 50 % limfocytów wytwarzających ADA , w innym efekt był 10-krotnie niższy. Po pewnym czasie aktywność enzymu spadała. Uzyskano jednak znaczną poprawę stanu klinicznego.

Inne próby terapii genowej w zespole SCID polegały na stymulowaniu układu odpornościowego w celu zwiększenia liczby komórek macierzystych, które izolowano z krwi, a następnie transfekowano genem ADA i ponownie implantowano pacjentom.

Najlepszy efekt uzyskano transfekując komórki macierzyste z krwi pępowinowej metodą ex vivo u noworodków z prenatalnym rozpoznaniem zespołu SCID. Było to działanie jednorazowe i w większości przypadków uzyskano efekt terapeutyczny, ale różnego stopnia.

Innym schorzeniem, w którym zastosowano terapię genową metodą ex vivo jest hemofilia typu B spowodowana niedoborem czynnika IX krzepliwości krwi. Czynnik ten produkowany jest przez hepatocyty. Terapeutyczny gen czynnika IX wprowadzano do fibroblastów skóry za pomocą wektora retrowirusowego. Ekspresja terapeutycznego genu utrzymywała się kilka miesięcy.

W hemofilii typu A wprowadzano gen wytwarzający czynnik VIII układu krzepnięcia do śródbłonka naczyń krwionośnych i uzyskano znaczne złagodzenie objawów klinicznych.

Terapia genowa w chorobach genetycznych warunkowanych monogenowo stwarza możliwość ich wyleczenia, a nie tylko częściowego łagodzenia objawów klinicznych jakie daje leczenie farmakologiczne stosowane obecnie.