Immunologia - prelekcja 10.15.2007.doc

Immunologia  - prelekcja 15.10.2007

Odporność nieswoista humoralna

Odpowiedź nieswoista cechuje się tym że:

·         Jest szybka, natychmiastowa

·         Receptory rozpoznające drobnoustroje są niezmienne w ciągu życia osobnika, kolejnych pokoleń (dziedziczne)

·         Jest selektywna (celem ataku nie są własne struktury)

·         Nie pozostawia po sobie trwałej pamięci immunologicznej

·         Rozwija się niezależnie od odpowiedzi swoistej

Nieswoiste mechanizmy obronne to przede wszystkim:

·         Skóra (rogowacjejący nabłonek, pot, łój)

·         Drogi oddechowe (kaszel, kichanie, wydzieliny śluzowo-surowicze)

·         Przewód pokarmowy (kwas solny, perystaltyka, złuszczanie się nabłonka, fizjologiczna flora bakteryjna produkująca kolicyny – substancje o charakterze bakteriobójczym zabijające bakterie zwłaszcza szczepów pokrewnych E. coli)

·         Krew, wydzieliny (laktoferyna, transferyna, interferony, lizozym)

·         Układ dopełniacza, białka ostrej fazy, lizozym, komórki żerne i NK

PAMP (ang. pathogen-associated molecular patterns, molekularne wzorce budowy patogenów) to najbardziej charakterystyczne struktury drobnoustrojów, selektywnie rozpoznawane w odpowiedzi nieswoistej. Zaliczamy do nich między innymi lipopolisacharydy, peptydoglikan, polisacharydy bakterii (składniki ściany), zymosan, mannany, dwuniciowy RNA. Receptory dla PAMP dzielą się na wolne (opsoniny) i związane z powierzchnią komórek – te ostatnie mogą uczestniczyć w procesie fagocytozy oraz aktywacji komórek, np. nabłonkowych.

Cząsteczki uczestniczące w mechanizmach odporności wrodzonej to:

·         Białka ostrej fazy

·         Kolektyny

·         Peptydy antybakteryjne

·         Lizozym

·         Cytokiny i interferony -> patrz kolejne prelekcje

Białka ostrej fazy (APP, ang. acute phase proteins) stanowią stały fizjologiczny składnik surowicy, w razie konieczności uczestniczący w odpowiedzi immunologicznej. Syntetyzowanie są głównie w wątrobie, zwykle na skutek stymulacji bakteryjnej. W warunkach fizjologicznych ich stężenie w surowicy jest małe lub śladowe, a pod wpływem stymulacji gwałtownie wzrasta w ciągu paru godzin (choć może też maleć w wypadku negatywnych białek ostrej fazy, np. transferyny). Mogą być również wytwarzane w odpowiedzi na cytokiny IL-1, IL-5, TNF, IFN-gamma produkowane przez aktywowane makrofagi i komórki NK. Główne funkcje APP to:

·         Wzmaganie aktywacji dopełniacza

·         Funkcja opsonin – głównie CRP, kolektyny, białko wiążące mannozę MBP oraz składniki dopełniacza.

·         Wzmaganie zabijania drobnoustrojów

·         Hamowanie wzrostu bakterii przez białka wiążące jony metali (odbieranie bakteriom potrzebnych mikroelementów) – transferyna, laktoferyna, ceruloplazmina, haptoglobina.

·         Ograniczanie uszkodzenia tkanek spowodowanego przez bakterie, urazy, nowotwory, reumatoidalne zapalenie stawów – fibrynogen wspomaga krzepnięcie krwi, inhibitory proteaz neutralizują enzymy lizosomalne uwalniane w czasie fagocytozy

Fibronektyna wiąże się z włóknikiem, zdenaturowanym, „pociętym” kolagenem, a także bezpośrednio z niektórymi bakteriami (np. gronkowcem złocistym), indukując przez swe receptory na komórkach żernych fagocytozę. Za pośrednictwem tego receptora makrofagi mogą fagocytować fragmenty uszkodzonych tkanek i ciała obce, na których odłożył się włóknik.

Białko CRP wiąże się z fosfocholiną bakterii, aktywuje dopełniacz (łączy się z C1q) oraz pełni funkcję opsoniny. Jego nazwa pochodzi od zdolności do wiązania się z wielocukrem C pneumokoków. Ilościowe oznaczanie tego białka u pacjentów z chorobami zapalnymi wykorzystywane jest do monitorowania bieżącej aktywności zapalnej w przebiegu choroby. Wysoki poziom CRP oznacza ostry przebieg choroby.

Surowiczy amyloid A (SAA) aktywuje dopełniacz (łączy się z C1q) oraz pełni rolę opsoniny.

Białko wiążące mannozę MPB łączy się z mannozą na powierzchni bakterii, a następnie z receptorami dla MPB (opsonizacja) oraz aktywuje dopełniacz.

Białko wiążące LPS łączy się ze ścianą komórek bakteryjnych.

Kolektyny to grupa rozpuszczalnych białek zdolnych do wiązania oligosacharydów na powierzchni niektórych drobnoustrojów. Strukturalnie przypominają one składnik C1q dopełniacza. Receptory dla kolektyn na makrofagach ułatwiają usunięcie i zniszczenie bakterii do których przyłączyły się kolektyny. Do kolektyn należą białko wiążące mannozę, konglutyniny, białka A i D surfaktantu płucnego.

Peptydy antybakteryjne wytwarzane są przez wiele różnych komórek, w tym komórki nabłonkowe i żerne. Odgrywają one ważną rolę w usuwaniu infekcji bakteryjnych w reakcjach odporności wrodzonej. Działanie antybakteryjne wykazują one na drodze różnych mechanizmów. Należą do nich m. in. cekropiny, magaininy i defensyny. Dwie pierwsze grupy powodują lizę, inne zaś interferują z transportem jonów. Peptydy przeciwbakteryjne wykazują aktywność zarówno przeciw bakteriom Gram-ujemnym jak i Gram-dodatnim. Jest to jeden z najstarszych ewolucyjnie mechanizmów obronnych. Ostatnimi czasy peptydy przeciwbakteryjne wzbudzają zainteresowanie medycyny jako leki – podjęte próby kliniczne z zastosowaniem peptydów kationitowych dały zadowalające wyniki m. in. w leczeniu owrzodzeń w przebiegu cukrzycy, profilaktyce zapalenia śluzówki jamy ustnej po chemioterapii, infekcji u dzieci z mukowiscydozą i wielu innych schorzeń.

Lizozym (muraminidaza) należy do białek kationowych. Odkryty został na początku lat 20. XX w. przez Fleminga. Obecny jest w ziarnistościach komórek żernych, a także w osoczu krwi, łzach, ślinie oraz wydzielinach śluzowo-surowiczych dróg oddechowych. Jego biochemiczne działanie polega na hydrolizie wiązania beta-1,4-glikozydowego między kwasem N-acetylomuraminowym i N-acetyloglukozaminą, które stabilizuje ścianę komórek bakteryjnych. Działa na wszystkie bakterie Gram-dodatnie z wyjątkiem Staphylococcus aureus.

Lizozym oznaczamy za pomocą następującej próby mikrobiologicznej: do żelu agarozowego dodajemy bakterii Micrococcus lisodeicticus, po czym nakrapiamy badaną wydzielinę z lizozymem. Rozbijanie ścian bakteryjnych daje przejaśnienia, których średnicę oceniamy, by ilościowo oznaczyć poziom lizozymu w badanej wydzielinie. Jest to bardzo trudna metoda ze względu na niewielką widoczność przejaśnień.

Wykonanie praktyczne:

Do 50 ml 2% r-ru agarozy wprowadzić zawiesinę bakterii Micrococcus lisodeicticus. Agarozę z zawiesiną szczepu rozlać (po 25 ml) do jałowych płytek Petriego. Po zastygnięciu agarozy wyciąć 4mm dołki, dodać po 50 ul badanych surowic i r-rów wzorcowych o znanym stężeniu lizozymu (kolejne rozcieńczenia lizozymu kurzego). Inkubować 24h w temp. 37 st. C w cieplarce w komorze wilgotnej. Po inkubacji widoczne strefy przejaśnienia wokół dołków.

Układ dopełniacza

System dopełniacza (C, complement) zbliżony do obecnie występującego u ssaków, zidentyfikowano także u ryb, płazów, gadów oraz ptaków. Drogi aktywacji alternatywnej drogi dopełniacza ukształtowały się prawdopodobnie ok. 600 mln lat temu – stąd wniosek że układ ten jest bardzo stary ewolucyjnie. Terminu „dopełniacz” użył po raz pierwszy Ehrlich w opisie aktywności surowicy, która może „dopełnić” zdolność swoistego przeciwciała do wywołania lizy bakterii.

Podstawowe funkcje dopełniacza to:

·         Obrona przeciwzakaźna (opsonizacja, liza)

·         Aktywacja fagocytów

·         Degranulacja kom. tucznych i bazofilów prowadząca do lokalnego wydzielania stymulatorów odczynu zapalnego

·         Współpraca odpowiedzi nieswoistej ze swoistą

·         Usuwanie zbędnych produktów - kompleksów immunologicznych, komórek apoptotycznych

Opsonizacja to zjawisko ułatwiania fagocytozy (zwłaszcza drobnoustrojów) w obecności surowicy, szczególnie odpornościowej. Czynnikami ułatwiającymi opsonizację – opsoninami – są składniki surowicy: przeciwciała IgG i IgM, kolektyny, białko CRP oraz fragmenty dopełniacza.

Na układ dopełniacza składają się białka, enzymy, układy pozytywnej i negatywnej regulacji oraz receptory. Należy do niego ok. 40 białek występujących w surowicy i płynach ustrojowych w postaci nieaktywnej, podlegających kaskadowej aktywacji, oraz białka regulatorowe. Miejscem ich syntezy są głównie hepatocyty, a także monocyty/markofagi i fibroblasty. Najwyższe stężenie w surowicy osiąga składowa C3 (1200 ul/ml).

Kaskada aktywacji dopełniacza

Aktywacja dopełniacza polega na serii zarówno enzymatycznych jak i nieeznymatycznych reakcji o charakterze kaskadowym. Każda z trzech dróg aktywacji prowadzi do utworzenia dwóch enzymów o charakterze proteaz: konwertzy C3 i konwertazy C5. Mają one zdolność wzmacniania kaskady aktywacji. Końcowe etapy wszystkich dróg aktywacji są dla nich wspólne, a ich celem jest utworzenie kompleksu atakującego błonę MAC (ang. membrane attacking complex).

Kolejność cyfr oznaczających kolejne białka dopełniacza (C – complement) nie jest związana z kolejnością ich udziału w kaskadzie aktywacji dopełniacza, chociaż w znacznym stopniu się z nią pokrywa. Dotyczy to jedynie odkrytej jako pierwsza, klasycznej drogi aktywacji dopełniacza. Białka biorące udział w pozostałych drogach nie są oznaczane cyframi. W drodze alternatywnej biorą udział czynniki B, D, H, I oraz P (properdyna), natomiast w drodze lektynowej – białko wiążące mannozę MBP i inne kolektyny, a także proteazy MASP-1 i MASP-2, u człowieka także fikoliny L i H.

C3

Jest głównym białkiem kaskady aktywacji dopełniacza, na nie bowiem działają konwertazy utworzone w wyniku działania wszystkich trzech dróg dopełniacza. Zbudowane jest z dwóch łańcuchów polipeptydowych, fizjologiczne stężenie C3 w surowicy wynosi 1200 ug/ml. Sytnetyzowane jest w wątrobie, monocytach, makrofagach, a także płucach, skórze, astrocytach oraz tkance tłuszczowej. Nieaktywowane przez konwertazę białko C3 bierze udział w opsonizacji, natomiast jego składowe:

·         C3a wraz z C5a i C4a bierze udział w chemotaksji i aktywacji leukocytów

·         C3b bierze udział we wzmaganiu odpowiedzi humoralnej oraz rozwoju pamięci immunologicznej - wraz z C4b, związanym kompleksem Ag:Ab odpowieddnio przez receptory CR2 na limf. B oraz CR2 i CR3 na komórkach dendrytycznych grudek

·         Fragmenty C3 wraz z C1q i fragmentami C4 biorą udział w usuwaniu kompleksów immunologicznych oraz komórek apoptotycznych.

Drogi aktywacji dopełniacza

AKTYWACJA

Droga klasyczna

Charakteryzuje ją zależność od przeciwciał związanych z antygenem w kompleksy immunologiczne. Dlatego właśnie układ zyskał nazwę dopełniacza – dopełnia bowiem funkcję przeciwciał, które same w sobie nie są zdolne do zniszczenia komórki drobnoustroju lub pasożyta. Zdolność do aktywacji tej drogi dopełniacza mają immunoglobuliny IgG (z wyjątkiem G4) oraz IgM.

Składnik C1 fizjologicznie składa się z dwóch odwracalnie połączonych ze sobą podjednostek C1q oraz tetrameru C1r2s2.

Przebieg drogi klasycznej aktywacji dopełniacza jest następujący:

1.       Przeciwciała przyłączają się do epitopów, co powoduje ich zmiany konformacyjne, a następnie do powstałych kompleksów immunologicznych przyłącza się cząsteczka C1q, kształtem podobna do wiązki sześciu tulipanów. Wiązanie C1q z jednym kompleksem immunologicznym jest słabe, ale związanie dwóch lub więcej sąsiadujących ze sobą kompleksów przez odpowiednią liczbę „główek tulipanów” znacznie zwiększa siłę wiązania, dzięki czemu może zajść dalsza aktywacja dopełniacza.

2.       W C1q zachodzi zmiana konformacyjna, która powoduje zmianę konformacyjną w obrębie C1r, eksponując miejsce enzymatyczne o właściwościach proteazy serynowej. Następnie poprzez ograniczoną proteolizę zachodzi trwała już aktywacja kolejnej proteazy serynowej C1s.

3.       Aktywowana C1s rozkłada białka C4 i C2. Najpierw rozkładany jest C4, z którego powstają fragmenty C4a i C4b. Pierwszy z nich, uwolniony do środowiska, pełni funkcję anafilatoksyny – patrz niżej.

4.       C4b łączy się z błoną komórkową poprzez zawarte w niej białka i cukry. Po przyłączeniu C4b do błony następuje

5.       przyłączenie C2 do C4b, po czym C2 zostaje rozłożony do C2a i C2b przez C1s. Powstały kompleks C4bC2a jest to konwertaza C3 drogi klasycznej, najistotniejsza dla prawidłowego działania układu dopełniacza

6.       Konwertaza C3 rozkłada C3 do C3a (kolejna anafilatoksyna) i C3b, a ten z kolei może przyłączyć się do błony komórkowej patogenu (6.1), lub do konwertazy C3, tworząc kompleks C4b2a3b, czyli konwertazę C5 drogi klasycznej.

7.       Konwertaza C4 rozkłada białko C5 do anafilatoksyny C5a i fragmentu C5b, który bierze udział we wspólnej końcowej drodze aktywacji dopełniacza – tworzeniu kompleksu MAC.

Opisane wyżej konwertazy znacznie wzmacniają efekt aktywacji – jedna konwertaza C3 produkuje setki tysięcy cząsteczek C3b, z których każda może utworzyć konwertazę C5. Każda z tych konwertaz C5 może wyprodukować sporo cząsteczek C5b, każda z nich zaś może utworzyć jeden kompleks MAC. W warunkach fizjologicznych jednak znaczna część cząsteczek C3b nie bierze udziału ani w reakcjach aktywacji dopełniacza, ani w opsonizacji patogenów, ponieważ ze względu na swoją wysoką reaktywność łączą się one z białkami w płynie tkankowym lub z wodą. Wytworzenie nadmiaru C3b jest więc niezbędne do aktywacji układu dopełniacza w ogóle, niemniej amplifikacyjna funkcja konwertaz jest bardzo istotna. Podobną rolę, jako „producent” C4b odgrywa składnik C1s.

Droga alternatywna (poperdynowa)

Droga ta rozpoczyna się spontanicznie i atakuje każdą dostępną błonę biologicznym, jest jednak unieszkodliwiana na komórkach własnego organizmu.

1.       W osoczu krwi występuje białko C3(H2O) podobne do składnika C3b drogi klasycznej. Wiąże ono czynnik B, który w obecności jonów Mg+ i czynnika D zostaje rozbity na fragmenty Ba i Bb.

2.       Fragment Ba wydostaje się do środowiska reakcji, natomiast fragment Bb wiąże się z C3(H2O). Powstały kompleks ma aktywność enzymatyczną, jest to (rozpuszczalna) konwertaza C3 drogi alternatywnej.

3.       Konwertaza ta rozkłada C3 tworząc fragmenty C3a i C3b – analogicznie do drogi klasycznej. Pierwszy fragment jest anafilatoksyną, drugi zaś łączy się z błoną komórkową.

4.       Związany z błoną C3b przyłącza czynnik B, który – analogicznie do powyższej reakcji – rozbijany jest do Ba i Bb. Po raz kolejny utworzona zostaje konwertaza C3 drogi alternatywnej, tym razem związana z błoną komórkową i dodatkowo stabilizowana czynnikiem P, czyli properdyną (stad druga nazwa drogi – properdynowa).

5.       Konwertaza C3 rozkłada C3 do C3a i C3b. Ten ostatni – podobnie jak powyżej – przyłącza się do błony komórkowej i łączy się z czynnikiem B, dając początek kolejnej konwertazie C3 (dodatnie sprzężenie zwrotne), lub przyłącza się do już istniejącej konwertazy C3, tworząc kompleks C3bBb3b czyli konwertazę C5 drogi alternatywnej.

6.       Analogicznie do drogi klasycznej konwertaza C5 rozkłada C5 do anafilatoksyny C5a i fragmentu C5b, który tworzy MAC.

Powiązanie dróg klasycznej i alternatywnej zachodzi dzięki czynnikowi C3b, bowiem wytworzony w drodze klasycznej C3b może po związaniu się z błoną tworzyć konwertazę C3 drogi alternatywnej.

Droga lektynowa

Jest podobna do drogi klasycznej, różnią się one jedynie pierwszymi etapami. W drodze lektynowej antygen nie musi być rozpoznany przez przeciwciała (niezależna od niedoborów humoralnych) – są one zastąpione przez białka nieswoiście wiążące cukry, czyli kolektyny. Białka te posiadają domeny lektynowe oraz długie ogonki o strukturze podobnej do kolagenu.

Kolektyna zapoczątkowująca drogę lektynową to białko wiążące mannozę MBL, występujące w osoczu. Budową przypomina ono czynnik C1q, posiada bowiem sześć główek umieszczonych na kolagenopodobnym trzonie:

Ogonek ten może wiązać proteazy serynowe MASP-1 oraz MASP-2. Gdy MBL zwiąże się z powierzchnią antygenu, w ogonku zachodzi zmiana konformacyjna, co powoduje aktywację MASP-1. Ta z kolei dokonuje proteolitycznego cięcia, a zarazem aktywacji MASP-2. Eznym ten ma zdolność rozkładania C2 i C4. Dalsze etapy reakcji są identyczne jak w drodze klasycznej. Kompleks kolektyna-MASP-1-MASP-2 zastępuje więc przeciwciało, jak i C1q, C1r i C1s drogi klasycznej.

Ze względu na swoje właściwości i wczesne pojawienie się w filogenezie MBL określana jest „paraprzeciwciałem”.

Droga alternatywna oraz lektynowa umożliwiają organizmowi natychmiastową reakcję obronną zaraz po wniknięciu do niego patogenu, droga klasyczna wymaga bowiem utworzenia swoistych przeciwciał, co następuje dopiero po pewnym czasie od infekcji.

Kompleks atakujący błonę

Powstaje on w wyniku reakcji nieenzymatycznych, Po wytworzeniu fragmentu C5b – na dowolnej drodze – dochodzi do jego połączenia się z C6. Następnie do powstałego kompleksu dołączane są C7 i C8. Powstaje kompleks C5b-8, który ma zdolność włączania się w błonę komórkową (co powoduje reorientację lipidów błony i jej deformację) i przyłączania cząstek C9. Przyłączenie 2-14 takich cząstek tworzy w błonie komórkowej nie regulowany kanał jonowy, którego średnica zależy od liczby przyłączonych C9. Przez kanał ten z komórki wypływają jony K+, ATP, makromolekuły, wpływa natomiast woda, jony Na+ i inne, a także lizozym oraz antybiotyki. Do zabicia jednej komórki E...