Oporność na makrolidy i linkozamidy – DD test / dwóch krążków
1. Oporność makrolidy i linkozamidy, warunkują trzy mechanizmy
a. zmiana miejsca wiązania na rybosomach spowodowana metylacją lub mutacją (target-site modification)
b. mechanizm aktywnego usuwania antybiotyku z komórki (efflux);
c. enzymatyczna inaktywacja
d. Najważniejsze są dwa pierwsze mechanizmy
2. Enzymatyczna inaktywacja antybiotyków odgrywa jedynie podrzędną rolę. Mechanizm działania makrolidów i innych przedstawicieli antybiotyków MLSB, do których należą linkozamidy, ketolidy i streptograminy grupy B polega na zablokowaniu syntezy bakteryjnych białek przez wiązanie się tych antybiotyków w centrum peptydylotransferazy, w obrębie podjednostki 50S rybosomów bakterii, co prowadzi do zahamowania translacji mRNA
3. Makrolidy i ketolidy upośledzają prawdopodobnie także proces tworzenia się nowych podjednostek 50S rybosomów bakterii z prekursorów, którymi są m.in. 5S i 23S rRNA
4. Modyfikacja miejsca docelowego
a. Metylacja rybosomalnego miejsca wiązania. Metylacja miejsca wiązania A2058 23S rRNA w obrębie dużej podjednostki 50S rybosomu prowadzi do zmian konformacyjnych 23S rRNA. Zapobiega to wiązaniu erytromycyny do jej miejsca docelowego (podobnie jak i innych makrolitów)
b. Wskutek nakładających się miejsc wiązania utrudnione jest również wiązanie linkozamidów i streptogramin grupy B, co prowadzi do krzyżowej oporności na wszystkie makrolidy, linkozamidy i streptograminy grupy B (tzw. fenotyp oporności MLSB).
c. Enzym metylaza odpowiedzialny za proces metylacji jest kodowany przez geny erm (erythromycin ribosome methylase), które są przenoszone przez plazmidy lub transpozony. Opisano dotąd ponad 40 różnych genów erm. Najważniejsze z nich należą do klas erm (A) i erm (C) – u gronkowców oraz do klasy erm (B) – u paciorkowców i enterokoków.
5. Mechanizm aktywnego usuwania antybiotyków z komórki (efflux)
a. Bakterie Gram(+) mechanizm ten, prowadzący do nabywania oporności na makrolidy, wiąże się z dwoma systemami transportu. W wypadku gronkowców są to transportery (białka błonowe – przyp. tłum.) ABC (ATP binding cassette) kodowane przez geny msr (A) (macrolide streptogramin resistance) przenoszone na plazmidach.
b. S. pyogenes, S. agalactiae i innych gatunków paciorkowców oraz u enterokoków mechanizm efflux jest uwarunkowany obecnością transporterów MSF (major facilitator superfamily), kodowanych przez geny mef (A) (macrolide-specific efflux).
6. Diagnostyka
a. Najprostszym i najbardziej niezawodnym fenotypowym testem wykrywania indukowalnej lub konstytutywnej oporności MLSB, uwarunkowanej genami erm jest test dyfuzji z krążka w agarze w formie testu zbliżeniowego dwóch krążków (DD-test). W teście tym stosuje się jeden krążek testowy z erytromycyną (15 mg) i jeden krążek testowy z klindamycyną (2 mg). Krążki nanosi się na płytkę agarową w odległości około 25 mm od siebie
b. Indukowalną oporność MLSB można stwierdzić na podstawie antagonizmu między erytromycyną i klindamycyną; daje się on rozpoznać dzięki powstawaniu szerokiej strefy zahamowania wzrostu wokół krążka z klindamycyną, spłaszczonej od strony krążka z erytromycyną (strefa zahamowania wzrostu w kształcie litery D)
7. Metoda dwóch krążków – DD test
a. Podłoże KBMHA
b. Zawiesina o gęstości 0,5 McFarlanda
c. Nanosimy zawiesinę na podłoże jałową wymazówką
d. Nakładamy krążki z erytromycyną 15 µ i klindamycyną 2 µ w odległości 15 mm od ich środka
e. Inkubacja 20-24 h temp 35 stopni
8. Odczyt:
a. strefa zahamowana wzrostu wokół krążka z erytromycyna wskazuje na średnią wrażliwość (16-20 mm) lub oporność <15mm i spłaszczenie przy krążku z klindamycyną (tzw strefa D) oznacza oporność na makrolity linkosamidy i streptograminy B typu indukcyjnego
b. strefa zahamowania wzrostu wokół krążka z erytromycyną i klindamycyną wskazująca na oporność (<15 mm) oznacza oporność na linkosamidy makrolidy i streptograminy B typu konstutywnego
c. strefa zahamowania wzrostu wokół krążka z erytromycyną wskazująca na średnią wrażliwość (16-200 mm) lub oporność (<15 mm) oraz brak spłaszczenia strefy wokół krążka z klindamycyną oznacza oporność typu M
ludi.lg