Wykład 10
Aflatoksyna staje sie toksyczna w wyniku aktywacji przez enzymy wewnątrzkomórkowe, czyli zwane cytochromy p450. Aflatoksyna w jakiś tam orzeszkach czy innego rodzaju żywności, która dotarła do nas z krajów tropikalnych nie jest szkodliwa. Staje sie szkodliwa dopiero w wyniku aktywacji przez enzymy wewnątrzkomórkowe. Jeżeli powstanie taka aktywacja, polega na koziołkiewicz coś rysuje.
Tutaj mamy wzór aflatoksyny. W pierścieniu mamy wiązanie podwójne, pod wpływe enzymów wewnątrzkomórkowych należących do cytochromów p450. to podwójne wiązanie jest utleniane, tworzy się taka postać jak tutaj zapisałam czerwonym pisakiem. Natomiast tutaj pojawia się dodatkowy atom tlenu i ten związek jaki powstaje w wyniku działania cytochromów p450 nazywamy epoksydem aflatoksyny.
Ten związek jest niezwykle reaktywny, jest tak reaktywny, że w zasadzie jego się nie da wyodrębnić z komórki. Czyli np. hodowali byśmy komórki ludzkie, mysie czy szczurze wszystko jedno dodalibyśmy aflatoksyny do podłoża, aflatoksyna weszłaby do komórek zostałaby utleniona przez cytochrom p450 do epoksydu , którego nie da się z tych komórek wyizolować. Jest on tak reaktywny, że natychmiast się łączy ze wszystkim co się znajdzie pod ręką, jeżeli to są białka, łączy się z białkami. Wiązanie epoksydu z białkami nie jest szczególnie niebezpieczne, dlatego że najwyżej jedna czy druga cząsteczka białka się uszkodzi i jest nie funkcjonalna, trzeba będzie po prostu zastąpić ją inną cząsteczką białka. Ale jeżeli ten epoksyd zaatakuje DNA to sytuacja jest poważniejsza, bo wtedy zostaje uszkodzone coś co stanowi materiał genetyczny. Na czym polega to uszkodzenie DNA. Więc taki epoksyd aflatoksyny może wejść do jądra komórkowego i może się związać z Guaniną (pokazuje jakiś slajd)
Ta guanina ma taką wrażliwą pozycje a mianowicie pozycję N7. Azot w pozycji 7 ulega metylacji przez dimetylosiarczan, o czym mówiła przy sekwencjonowaniu DNA, ale może ulec również uszkodzeniu przez aflatosynę. Cała ta cząsteczka tutaj to aflatoksyna, zaznaczony na niebiesko ten fragment aflatoksyny gdzie występuje epoksyd i teraz tworzy się kowalencyjne połączenie między Guaniną, a aflatoksyną. Ponieważ jest to jakby dodanie aflatoksyny do guaniny, a dodanie to jest addycja, inaczej mówimy, że ma tutaj miejsce addycja aflatoksyny do guaniny. W tym momencie mówimy, że DNA zostało uszkodzone, ten produkt jaki się tu tworzy to jest addukt. Kiedy bedziemy charakteryzować system NER to powiemy sobie, że system NER naprawia duże addukty. Naprawia takie sytuacje kiedy takie duże paskudztwo jak ta aflatoksyna przyłącz się do DNA.
Innym takim związkiem który przyłącza się do DNA w taki sam sposób jak aflatoksyna jest benzopiren. Oczywiście można powiedzieć, że my z benzopirenem nie mamy nic wspólnego, my tylko lubimy dobrze uwędzoną szyneczkę, albo dobrze wysmażone mięso, no i to jest właśnie źródło benzopirenu. Benzopiren jest kancerogenem, szczególnie jego działanie daje się we znaki tym społeczeństwom, populacją które lubią dobrze uwędzoną szynkę. Są to np Japończycy którzy wszystko wędzą. I powiedzmy poziom zachorowań i poziom nowotworów żołądka wśród Japończyków jest dość wysoki właśnie dlatego, że ich żywność często poddawana jest wędzeniu. Jeżeli mamy takie addukty to to jest uszkodzenie, to jeszcze nie jest mutacja, ponieważ takie uszkodzenie może, a nawet powinno być naprawione przez enzymy systemy NER. Jeżeli taka aflatoksyna przyłączy się do jakiegoś tam fragmentu DNA, który jest np. fragmentem nie kodującym, no i to uszkodzenie zostanie naprawione bez żadnego problemu. Jeśli jednak z jakiegoś powodu uszkodzenie nie zostanie naprawione np. system NER jest za mało wydajny, my tak zatruwamy swój organizm jakąś niewłaściwą żywnością np., lub pracując w szkodliwych warunkach, jeżeli jest właśnie taka sytuacja, że nie dbamy o siebie to może się zdarzyć, że system NER nie jest w stanie naprawić wszystkich uszkodzeń. I co się wtedy dzieje? Wtedy może dojść do mutacji. W przypadku aflatoksyny, ponieważ tutaj mamy uszkodzenie guaniny, to taka uszkodzona guanina jest odczytywana po jednej czy dwóch rundach replikacyjnych jako Adenina i w kolejnej rundzie replikacyjnej zostaje przyłączona do nowej nici DNA Tymina. Czyli aflatoksyna prowadzi, (coś rysuje) jeżeli mamy nić DNA z uszkodzoną Guaniną , druga nić jest prawidłowa, jeżeli teraz nastąpi replikacja tej nici z Guaniną to enzym polimeraza zamiast tej uszkodzonej guaniny odczyta, że w tym miejscu jest Tymina i w tej nowej nici komplementarnej do tej nici z uszkodzeniem wprowadzi Adeninę, tu wprowadza do nici komplementarnej adeninę, a w następnej nici która powstaje w następnej rundzie replikacyjnej wprowadza tyminę.
Czyli ta nić jest identyczna z tą jeśli chodzi o sekwencję nuklotydów, ale w tym miejscu zamiast guaniny jest tymiana i to nazywamy transwersją, o tym mówiłam. Czyli aflatoksyna prowadzi do transwersji G do T. Mutacja to jest zmieniony nukleotyd, zmieniony w skutek tego, że polimeraza źle odczytuje sens tej uszkodzonej zasady nukleinowej. I jeżeli to dotyczy np. białka p53 , istotne jest jaki gen zostaje uszkodzony, jaki gen zostaje zmutowany, najbardziej niebezpieczne jest uszkodzenie, a potem mutacja np. genu kodującego np. białko p53.
Mamy tu omówioną taką sytuację kiedy to mamy te dwa ważne kodony białka p53 czyli kodony 248 i 249 w normalnej sekwencji powinno być CGG i AGG, te dwie sekwencje kodują argininę. To są te dwie ważne argininy dzięki którym białko p53 wiąże się ze specyficzną sekwencją DNA. Jeżeli nastąpi mutacja, czyli nastąpi transwersja G do T, to zamiast jednej z tych reszt guaniny mamy tyminę, zamiast drugiej też mamy tyminę. Ponieważ kod genetyczny jest zdegerowany i wiemy, że ten kodon zawierający w trzeciej pozycji inny nukleozyd to nie koniecznie prowadzi do zmiany w sekwencji białka. Czyli jeśli mamy CGT to nadal mamy argininę ponieważ kodon CGG i CGT oba te kodony kodują argininę. Jest mutacja na poziomie DNA ale na poziomie białka wszystko jest w porządku. W tym wypadku jest inaczej bo AGG koduje argininę ale AGT koduje serynę i tu już mamy mutację.w tym miejscu. Jeśli w wyniku tego uszkodzenia przez aflatoksynę nastąpi zmiana, nastąpi transwersja w przypadku tej środkowej guaniny, to jest losowo która z tych dwóch reszt guaniny ulegnie uszkodzeniu, może paść na jedną, może paść na drugą, więc w tej sytuacji mamy kodon CTG kodon CT już nie jest tak dobrze jak na górze, że żadnych zmian nie odnotowano, tu kodon CTG prowadzi do leucyny, a kodon ATG do metioniny w obu tych przypadkach mamy mutację. Teraz jeszcze raz cały ciąg myślowy, mamy aflatoksynę , aflatoksyna ulega utlenieniu przez cytochrom p450, epoksyd jest bardzo reaktywny łączy się za wszelką cenę z różnymi biomolekuami, jeżeli połączy się z Guaniną w DNA tworzy się addukt aflatoksyny i DNA to jest uszkodzenie, które może być naprawione przez system NER i nie bedzie po nim śladu, jeżeli uszkodzenie nie ulegnie naprawieniu to wówczas po dwóch rudach replikacyjnych mamy DNA które zawiera mutację ta mutacja to transwersja G do T i ten zmieniony nukleotyd może być przyczyną mutacji punktowej kodującej dane białko. Jeżeli jest to gen kodujący białko p53 to mamy bardzo poważne konsekwencje, ponieważ to białko jest tzw. strażnikiem genomu i teraz ten strażnik genomu jest zmutowany i nie funkcjonalny, a w każdym razie jego aktywność biologiczna jest zmniejszona. Ale oprócz takich dużych uszkodzeń gdzie do DNA może się przyłączyć aflatoksyna, istnieje również szereg tzw. małych uszkodzeń DNA. Małe to nie znaczy mniej niebezpieczne one są tak samo niebezpieczne tyle tylko, że są naprawiane przez inny system naprawy.
Co zaliczamy do małych uszkodzeń DNA np. przyłączenie grupy hydroksylowej, albo przyłączenie grupy metylowej. Kiedy mamy doczynienia z takimi uszkodzeniami, które polegają np. na przyłączeniu grupy metylowej, otóż nie jest tajemnicą, że przemysł chemiczny ma istotne znaczenie i powiedzmy sporo osób pracuje w przemyśle chemicznym i ma kontakt z różnego rodzajem odczynnikami i może się zdarzyć że tam składnikiem jakiś preparatów są czynniki toksyczne takim czynnikiem jest np. metylometanosulfonian (MMS) ten związek może powodować metylację guaniny.
Tutaj znowu mamy guaninę i tym razem dochodzi do przyłączenia grupy metylowej do atomu tlenu w pozycji O6. Czyli MMS jest czynnikiem alkilującym ( taki który ma grupę alkilową, która może przyłączyć się do zasady nukleinowej) Tworzy się w ten sposób coś co nazywamy O6 – metyloguaniną. Jeśli chodzi o ten związek, o to uszkodzenie jest ono naprawiane przez jeden jedyny enzym, to jest rzadka sytuacja kiedy uszkodzenie może być naprawione przez jeden pojedynczy enzym. Najczęściej uszkodzenia wymagają systemów naprawy. System naprawy to jest powiedzmy system białek, grupa białek, grupa enzymów które muszą współdziałać ze sobą aby usunąć uszkodzenie. Jeżeli mamy aflatoksynę to nie ma jednego białka które usunie aflatoksynę z DNA, potrzebny jest system kilkunastu białek które muszą ze sobą współpracować aby usunąć aflatosynę. W przypadku O6 – metyloguaniny jest dużo łatwiej bo tu wystarczy jeden enzym, który nazywa się metylotransferaza metyloguaniny (MTMG)
Kiedy dochodzi do utlenienia zasad nukleinowych, w skutek działania wolnych rodników tlenu, czyli reaktywnych form tlenu. Jeżeli stosuje się np. promieniowanie jonizujące, radioterapia jest taką metodą która polega na stosowaniu promieniowania jonizującego które jest odpowiednio nakierowane na chorą tkankę, chore komórki po to aby uszkodzić DNA tych komórek. Dlatego, że w skutek działania tego promieniowania powstają reaktywne formy tlenu, czyli takie formy tlenu które mają charakter rodnikowy i one są bardzo reaktywne. I próbując przereagować z czymś reagują m.in. z zasadami nukleinowymi i efektem jest utlenienie zasad nukleinowych np. 5- hydroksycytozyna pojawia się dodatkowa grupa hydroksylowa, glikol tyminy czyli mamy tyminę z dwoma dodatkowymi grupami hydroksylowymi to jest po prostu uszkodzona zasada nukleinowa. Czyli zasady nukleinowe zawierające dodatkową grupę hydroksylową w różnych pozycjach są efektem działania tych wolnych rodników. Dlatego my się tych wolnych rodników tak boimy. Zmiataczami wolnych rodników są niektóre witaminy także polifenole, ponieważ w ten sposób powodujemy, że część tych wolnych rodników jest wyłapywana przez polifenole, przez witaminy i wtedy mniej tych wolnych rodników dociera do DNA. Ale nie możemy się łudzić, choćbyśmy pakowali w siebie ogromne ilości witamin lub polifenoli to i tak część wolnych rodników będzie atakować DNA. I takie DNA musi być naprawiane przez system który się nazywa BER. Jest to system kilku białek które mają za zadanie usunąć z nici DNA uszkodzoną zasadę nukleinową. Te białka usuwają cała zasadę nukleinową one nie mogą tylko odciąć te dodatkowe grupy hydroksylowe trzeba usunąć całą zasadę nukleinową. Czyli my tłumaczymy ten system BER jako naprawa poprzez wycięcie zasady nukleinowej.
8 – hydroksyguanina jest to guanina która w pozycji 8 ma grupę hydroksylową. Są metody i badania wykrywania 8 – hydroksyguaniny (coś zaznaczyła na czerwono) to co zaznaczyłam na czerwono to są mutacje jakie występują jeśli to uszkodzenie ta grupa hydroksylowa nie zostanie naprawiona.
Jeżeli mamy 8 – hydroksyguaninę to ona powinna być wycięta przez system BER i na to miejsce powinna być wprowadzona właściwa guanina. Jeżeli system BER nie zadziała to wówczas polimeraza w procesie replikacji odczyta taką 8 – hydroksyguaninę w taki sposób, że w kolejnej rundzie replikacyjnej w tym miejscu pojawi się Tymina, czyli mamy transwersję G do T. Jeżeli mamy 8 – hydroksyadenine to tutaj mamy transwersję A do G, albo transwersje Ado C. I tak po kolei 2 – hydroksyadenina, 5- hydroksycytozyna oraz glikol tyminy. Być może państwu wiadomo, że takim przeciw utleniaczem wolnych rodników jest witamina C i istnieje takie przekonanie, że w okresie jesienno – zimowym, żeby się zabezpieczyć przed przeziębieniem, przed wirusami dobrze jest łykać zwiększoną dawkę witaminy C. Przeprowadzono badania, że jeżeli ktoś zażywał takie 0,5g czy 1g dawki witaminy C to w jego DNA stwierdzono zmniejszony poziom 8 – hydroksyguaniny. Udowodniło to, że witamina C ma działanie ochronne w stosunku do DNA, zmiata wolne rodniki, wolne rodniki nie docierają do DNA i nie powstaje 8 – hydroksyguanina. Dopiero po jakimś czasie można było wykrywać w DNA nie tylko 8 – hydroksyguaninę ale również inne zasady które są utlenione, i co się wtedy okazało. Okazało się, że owszem jeżeli bierzemy końskie dawki witaminy C tak około 1g dziennie to zmniejsza się poziom 8- hydroksyguaniny, ale rośnie poziom innych utlenionych zasad nukleinowych. Można brać takie dawki witaminy C ale przez tydzień, przez 10 dni natomiast branie takich ilości wit. C przez 3 miesiące nie ma sensu, może wręcz powodować wzrost poziomu utlenionych zasad nukleinowych. Czasami stosuje się leki przeciwnowotworowe które mają za zadanie uszkadzać DNA. Te leki uszkadzają DNA we wszystkich komórkach nie tylko w nowotworowych. Wobec tego na co liczą lekarze , na co liczą farmakolodzy w takiej sytuacji. Na to, że w zdrowych komórkach sprawnie działają systemy naprawy. Czyli jeżeli lek przeciwnowotwrowy przyłącza się do DNA i tworzy addukt takim lekiem jest cis-platyna , to w zdrowych komórkach systemy naprawcze powodują szybką naprawę takich uszkodzeń spowodowanych przez cis-platynę. Cis-platynę stosuje się w określonych nowotworach ponieważ stwierdzono w ciągu wielu lat badań, że w tych rodzajach nowotworów jest duże prawdopodobieństwo, że w komórkach nowotworowych jest uszkodzony system naprawy. Czyli mamy komórki nowotworowe z uszkodzonym systemem naprawy i komórki zdrowe z dobrze działającym systemem naprawy. I teraz ten lek którym jest cis-platyna powoduje uszkodzenie DNA w komórkach nowotworowych i tak samo w komórkach prawidłowych. Tylko teraz wszystko zależy od sprawności systemu naprawy w komórkach zdrowych, powinien zadziałać szybciej sprawniej i naprawić. W komórkach nowotworowych tej naprawy nie ma i komórki nowotworowe giną. Problem polega na tym, że populacja komórek nowotworowych nie jest jednolita. Czyli tam wśród tych komórek nowotworowych 90,80,70% zginie pod wpływem działania tej cis-platyny, ale pozostanie 10,20,30% mamy poprawę. Ale komórki które pozostały miały całkiem sprawnie działający system naprawy. Po jakimś czasie okazuje się że reakcja pacjenta nie jest tak dobra jak na początku leczenia, bo udało się zniszczyć te najbardziej wrażliwe komórki na cisplatynę, ale pozostała pewna ilość komórek które na ten lek są oporne bo mają system naprawy. Niemniej jednak cisplatyna jest jednym z częściej stosowanym lekiem przeciwnowotworowym.
DRUGA GODZINA WYKŁADU.
Systemy naprawy. Najprostszy mechanizm naprawy to taki, w którym potrzebny jest tylko jeden enzym. Jeżeli mamy odczynienia z taka metodą to określmy ją mianem rewersji bezpośredniej. Czyli gdziekolwiek mówimy że jakieś uszkodzenie DNA zostało naprawione w wyniku rewersji bezpośredniej to znaczy, że w tym procesie bierze udział tylko jedno białko (enzym). Przykładem rewersji bezpośredniej jest naprawa uszkodzeń spowodowanych przez promieniowanie UV.
Takie uszkodzenie polega na tworzeniu dimerów pirimidynowych. Dimer pirimidynowy czyli leżące nad sobą dwie pirymidyny np. dwie tyminy, albo tymina – cytozyna które są połączone ze sobą jednym albo dwoma wiązaniami kowalencyjnymi dodatkowymi. To powoduje usztywnienie struktury DNA i może być przyczyną mutacji. Takie uszkodzenie jest naprawiane przez system NER, ale są bakterie które nie muszą do tego wykorzystywać systemu NER ponieważ mają one enzym który się nazywa fotoliaza. Ten enzym może naprawić takie uszkodzenie, może zerwać te dodatkowe wiązania kowalencyjne.
Schemat pokazuje normalne DNA nie uszkodzone, DNA gdzie doszło do uszkodzenia, czyli powstał dimer, tutaj ten różowy to jest fotoliaza, która wiąże się, która rozpoznaje to miejsce uszkodzenia i teraz fotoliaza potrzebuje światła o długości fali ponad 300nm, ulega w ten sposób aktywacji i może naprawić uszkodzenia. Nie wszystkie bakterie mają fotloliazę, część z nich nie mają i one muszą wykorzystywać do naprawy dimerów pirymidynowych systemu NER, podobnie u ludzi. W naszych komórkach jeśli sobie pójdziemy na plażę albo jeszcze gorzej do solarium i powstaną uszkodzenia czyli dimery pirymidynowe to u nas takie uszkodzenia może naprawić tylko system NER. Czyli przykładem rewersji bezpośredniej jest działanie fotoliazy u niektórych bakterii.
Drugim takim białkiem które może naprawić DNA, też jest przykładem tej rewersji, jest enzym metylotransferaza – O6 – guaniny. Jest to dziwny enzym i jeżeli sprawdzimy jak on działa to powiemy, że to w ogóle nie jest enzym. Dlatego, że jeżeli mamy taką metylowaną guaninę, czyli mamy guaninę która w pozycji O6 ma grupę metylową. (rysuje wzór guaniny z przyłączoną grupą metylową) Tutaj mamy grupę metylową i ten enzym usuwa tą grupę metylową. W jaki sposób? Otóż ściąga ją z tego atomu tlenu i wiąże kowalencyjnie z siarką z jednej ze swoich reszt cysteiny. Czyli enzym metylotransferaza – O6 – guaniny przenosi bezpośrednio tą grupę metylową na swoją własną cysteinę, czyli tworzy się wiązanie kowalencyjne między tą grupą metylową a siarka reszty cysteiny. Okazuje się, że nie ma sposobu aby usunąć grupę metylową z cysteiny tego białka. Czyli gdybyśmy sobie przypomnieli definicję enzymu który może wielokrotnie katalizować daną reakcję bo się nie zużywa, no to ta metylotransferaza – O6 – guaniny nie jest enzymem. Bo ona w pojedynczym akcie katalitycznym się zużywa, ponieważ przeniosła grupę metylową na swoją cysteinę i nie może po raz dugi ściągnąć tej grupy metylowej. Można by powiedzieć, że ten enzym jest bardzo nie efektywny, wystarczy, że w komórce pojawi się grupa metylowa DNA w tysiącu różnych miejsc w DNA i do tego potrzeba tysiąc cząsteczek białka. Otóż ten enzym w momencie kiedy wiąże się z grupą metylową w sposób nieodwracalny, nie traci nic na znaczeniu wręcz przeciwnie on się staje w tym momencie czynnikiem transkrypcyjnym, który aktywuje transkrypcję swojego własnego genu. Wyobraźcie sobie, że robicie eksperyment: dwie grupy mają hodowle bakterii. Jedna grupa ma dodać metylometsnosulfonian czyli czynnik alkilujący i druga grupa też ma dodać czynnik alkilujący. Ale jedna grupa się pomyliła, jedna grupa dodała stężenie x, a druga 1000x , każda grupa wsadziła swoje hodowle do cieplarki, następnego dnia okazuje się, że Ci którzy dodali 1000 razy mniej sulfonianu mają hodowle w pełni okazałą, a Ci którzy dodali 1000 razy więcej sulfonianu mają bakterie wybite co do jednej. I teraz ta druga grupa dodaje taką samą dawkę sulfonianu pierwszej grupie, aby zabić ich bakterie. Ale okazuje się, że po dobie bakterie mają się znakomicie. Dlaczego tak jest? Dlatego, że z tych hodowli bakteryjnych miała po kilka, kilkanaście albo kilkadziesiąt cząsteczek metylotransferazy –O6-guaniny. Ta hodowla która dostała niskie stężenie metylometanosulfonianu oczywiście miała uszkodzone DNA ale w niewielkim stopniu metylotransferaza usunęła te grupy metylowe z DNA w ten sposób enzym stał się nieaktywny, ale stał się czynnikiem transkrypcyjnym. I ten czynnik transkrypcyjny uruchomił transkrypcję własnego genu. Czyli przez pierwszą dobę kiedy mamy niski poziom tego czynnika, rośnie poziom ekspresji metylotransferazy –O6-guaninowej. Druga grupa z powodu stężenia 1000 razy większego nieodwracalnie wytłukła swoje bakterie ponieważ poziom uszkodzeń DNA był tak wysoki, a ilość białka tak mała, że nawet uruchomienie tej transkrypcji niewiele dało. Zanim pojawiła się większa ilość białka bakterie tego już nie przeżyły. Natomiast jeżeli następnego dnia chcieliśmy dodać 1000 razy więcej metylometanosulfonianu to te bakterie już były przygotowane bo bakterie te miały już wysoki poziom enzymu zgodny do naprawy. Pojawia nam się takie nowe określenie odpowiedź adaptacyjna. Rewersja bezpośrednia czyli taki sposób naprawy gdzie jest jeden enzym i drugie określenie odpowiedź adaptacyjna odpowiedź która wymaga czasu i w tym czasie zwiększa się transkrypcja określonego białka, określonego enzymu i organizm w tym wypadku bakteria są przygotowane na większą dawkę, większe stężenie tej substancji szkodliwej.
Chciałabym omówić pewien system który występuje u bakterii ma różne nazwy: naprawa SOS, mutageneza SOS. Patrząc na nazwy można by stwierdzić że jest to sprzeczność, bo albo naprawa, albo mutageneza. Mutageneza są to warunki w których dochodzi do mutacji. A myśmy powiedzieli sobie, że naprawa to proces który ma nie dopuścić do mutacji. Musimy sobie wyjaśnić co to za system który jest naprawą, a tak naprawdę jest pierwszym krokiem do mutagenezy. Otóż jest to bardzo stary system naprawy, czy system zabezpieczenia się przed skutkami uszkodzenia DNA. Nam się wydaje, że przez ostatnie 50 lat tak bardzo zanieczyściliśmy środowisko, że dopiero teraz my i inne organizmy jesteśmy narażeni na mutację. Otóż nie jest to prawdą, na początku istnienia życia atmosfera która istniała dookoła ziemi miała inny skład, i organizmy które wówczas istniały były narażone na silne promieniowanie UV. Co to jest za system SOS. Wyobraźmy sobie taką sytuację że zadziałało takie silne promieniowanie UV i nastąpiło uszkodzenie DNA i powiedzmy tych dimerów pirymidynowych powstało dużo. Może być tak sytuacja mamy stałą nić DNA w której została uszkodzona zasada nukleinowa w jakiś sposób może to być dimer pirymidynowy, albo powstało tzw. miejsce apurynowe, czy apirymidynowe to znaczy takie miejsce bez zasady nukleinowej. Teraz zaczyna sie proces replikacji nie powinien się zacząć ale się zacząć bo bez tego bakterie nie mają szansy na przedłużenie swojej egzystencji. Polimeraza spokojnie pomyka sobie tutaj ale dochodzi do tego miejsca, tu nie ma żadnej informacji płynącej z nici matrycowej co tutaj włączyć, nie wiadomo jaką ma tu zasadę nukleinową włączyć. Jaka by to nie była zasada to parowanie czyli wiązania wodorowe nie będą tutaj prawidłowe. Jaka jest szansa że włączenie jakiegokolwiek nukleotydu tam w miejsce znaku zapytania będzie prawidłowe. Jest to 25%. Ale jeżeli bierzemy teraz pod uwagę te pozostałe 75%, jeżeli zostanie popełniony błąd. To pewnie jakieś 99% z tych 75% to będzie szansa że będzie to mutacja negatywna tzn. mutacja utraty funkcji. Ale jakiś 1% z tych 75% to jest szansa na to że ta mutacja będzie pozytywna. Czyli bakteria zyska coś czego do tej pory nie miała. Na czym polega system naprawy? Najważniejsza właściwość polimerazy DNA to aktywność 3’ – 5’ egzonukleazy czyli aktywność sprawdzającą. Załóżmy że tutaj cokolwiek zostanie włączone, jedna z 4 zasad nukleinowych. Aktywność 3’ – 5’ egzonukleazy wytnie to coś wszystko jedno czy to będzie dobra zasada nukleinowa czy zła. Więc w tym momencie wcale nie zależy bakterii na tym żeby zadziałała 3’ – 5’ egzonukleaza. Ją trzeba wyhamować. System naprawy SOS, albo mutagenezy SOS polega na wyciszeniu aktywności 3’ – 5’ egzonukleazy. Dlatego ten rodzaj naprawy nazywamy naprawą ostatniej szansy to jest taka sytuacja kiedy możemy powiedzieć że tonący chwyta się brzytwy. Bo nie ważne co by włączył ale może to być szansa na przeżycie. Jak dochodzi do wyciszenia tej aktywności 3’ – 5’ egzonukleazy (pokazuje jakiś schemat) mamy w bakterii taki operon umu i w pewnym miejscu w genomie bakterii istnieje ten właśnie operon. Składający się tak naprawdę z dwóch genów struktury umuD i umuC i teraz ten operon jest wyciszony jest wyciszony przez białko lexA to jest represor. Dochodzi do wyłączenia DNA to promieniowanie UV jest dalej duże. DNA jest dalej uszkodzone i w wyniku uszkodzenia DNA pojawiają się w komórce wolne końce DNA. To jest nieprawidłowość bo u bakterii genom jest koliście zamknięty, ale nastąpiło uszkodzenie DNA to tu to tam rozerwanie nici, brak zasady nukleinowej, dimery. W tej sytuacji te wolne końce DNA są takim czynnikiem zwiększa ekspresję białka Rec-A to jest coś w stylu białka p53 u bakterii. To białko ma bardzo duży wpływ na ochronę genomu bakterii. Zwiększa się ilość białka Rec-A i to białko katalizuje degradację białka lexA. Czyli następuje degradacja represora blokującego operon umuDC. I teraz następuje ekspresja tych dwóch genów D i C i powstają dwa białka umuD i umuC. umuD jest nie aktywny ale białko Rec-A powoduje częściową degradację umuD powstaje umuD’. Teraz te dwa białka umuD’ i umuC tworzą aktywny kompleks dwie cząsteczki umuD’ i jedna cząsteczka umuC tworzą mutasom. Jest to kompleks który sprzyja powstawaniu mutacji, czyli jest to ten kompleks który hamuje aktywność 3’-5’ egzonukleazy. Jeżeli dzięki tej mutacji populacja bakterii będzie istnieć to zawsze w niej znajdzie kilka które będą mutantami, będą miały jakieś inne zdolności, albo pojawi się tam kilka bakterii które szczęśliwie uniknęły mutacji. Jeżeli nawet z tych 10 mln bakterii przetrwa 10 nieuszkodzonych komórek bakteryjnych albo z jakąś dodatkową pozytywną cechą to jest to szansa na przetrwanie populacji. Taki jest biologiczny sens tego systemu odpowiedzi SOS czy mutagenezy SOS.
Dwa najważniejsze systemy naprawy czyli: naprawa przez wycięcie zasady nukleinowej czyli system BER i naprawa przez wycięcie nukleotydu system NER. Systemy BER i NER istnieją zarówno u bakterii jak i u eukariontów.
W przypadku systemu BER chodzi o wycięcie pojedynczej zasady nukleinowej, w niektórych przypadkach wycięcie dwóch, góra trzech nukleotydów.
W systemie NER nie chodzi o wycięcie jednego nukleotydu tylko kilkunastu, u bakterii w systemie NER wycinane jest 12 nukleotydów, a u eukariontów mamy wycięcie 29 nukleotydów.
Generalnie zarówno w systemie NER jak i BER naprawa jest skuteczna wtedy gdy jedna nić DNA jest prawidłowa, czyli uszkodzenie jest tylko w jednej nici DNA. Dlaczego jest to ważne? Dlatego że ta prawidłowa nić DNA będzie stanowić matrycę do naprawy uszkodzenia. Pierwszy etap polega na zlokalizowaniu uszkodzenia, muszą być enzymy które rozpoznają uszkodzone miejsce. Najważniejsza rzecz rozpoznanie uszkodzenia. Po rozpoznaniu muszą się pojawić enzymy, jeden albo dwa które wytną uszkodzenie. Czyli musza tu występować endonukleazy zarówno w systemie BER jak i NER. Kiedy dojdzie do wycięcia uszkodzenia mamy taką sytuację kiedy druga nić musi służyć jako matryca. Teraz dochodzimy do właściwego momentu naprawy, czyli wypełnienia tej luki przez nowe nukleotydy. I w przypadku jak BER potrzebujemy dwóch enzymów polimerazy I i ligazę, aby połączyć. Najpierw potrzebne są specyficzne enzymy potrzebne do rozpoznania uszkodzenia, potem są potrzebne specyficzne endonukleazy do wycięcia tego uszkodzenia, a potem polimeraz I i ligaza.
Tak samo jest w przypadku systemu NER. Najpierw rozpoznanie ale tutaj trzeba rozpoznać inny rodzaj uszkodzeń, to nie mogą być te same białka co w przypadku BER. Tak samo endonukleazy są inne niż w przypadku BER. Natomiast polimeraza I i ligaza są te same. U eukariontów właściwie schemat naprawy jest taki sam, zamiast polimeraz I proces naprawy katalizują polimerazy delta i epsilon. Nie do końca wiemy w jakich sytuacjach działa jedna a w jakich druga. Zarówno w przypadku systemu NER jak i BER mamy naprawę poprzez wymianę.
System NER występuje zarówno u eukariontów jak i bakterii, ale jest inny. Inne białka tworzą system NER u bakterii inne u eukariontów. Dwa główne czynniki transkrypcyjne TF2D on rozpoznaje kasetę TATA i TF2H czynnik ten nie jest tylko czynnikiem biorącym udział w transkrypcji, jest on helikazą i jest kinazą która aktywuje polimerazę. Oprócz tego czynnik TF2H wchodzi w skład systemu NER. Zaobserwowano, że u eukariontów szybciej ulegają naprawie geny które są w tym samym czasie transkrybowane. To było logiczne. Jeżeli gen jest transkrybowany jeżeli jest w nim uszkodzenie, to należy to uszkodzenie szybko naprawić aby ten błąd nie przeniósł się na RNA. Żeby zadziałał system NER potrzebny jest czynnik TF2H, a on występuje tam gdzie jest transkrypcja. W ten sposób wyjaśniono dlaczego naprawa z udziałem systemu NER przebiega szybciej i efektywniej, w tych regionach gdzie właśnie zachodzi transkrypcja. Zdarza się ale bardzo rzadko że białka tworzące system NER są zmutowane. I jeżeli mamy taką sytuację to jest to przyczyna występowania bardzo poważnych chorób uwarunkowanych genetycznie. Po pierwsze u osób z uszkodzonym systemem NER wzrasta 1000 krotnie ryzyko wystąpienia chorób nowotworowych. Skoro uszkodzenia nie są naprawiane, to jest bardzo duże prawdopodobieństwo że ulegną one mutacji. ąąą
ewastyna1