Analityka 3.pdf

Antybiogram – jest wynik badania wrażliwości danego drobnoustroju na działanie określonego

antybiotyku lub chemioterapeutyków.

Metody określania wrażliwości:

- metoda dyfuzyjno-krążkowa

- metody rozcieńczeniowe

- Etest

1. Metoda dyfuzyjno-krążkowa (metoda Kirby-Bauera) – najczęściej używana metoda testowania

lekooporności. Oparta jest na dyfuzji antybiotyku zawartego w krążku do podłoża. Antybiotyk

dyfunduje promieniście, tworząc gradient stężeń. Największa jego koncentracja występuje przy

brzegach krążka i spada wraz z odległością od krążka. Wielkość strefy zahamowania wzrostu bakterii

jest wprost proporcjonalna do stopnia wrażliwości bakterii na antybiotyk - im większa jest strefa

zahamowania, tym bakteria jest bardziej wrażliwa. W zależności od wielkości strefy, bakterie określa

się jako: wrażliwe, średnio wrażliwe lub oporne na podstawie przyjętych standardów (rekomendacje).

Jest to metoda dobrze wystandaryzowana, powtarzalna, relatywnie tania.

Ograniczenia: nie jest wiarygodna w testowaniu wolno-rosnących organizmów i bezwzględnych

bakterii beztlenowych. Niektóre antybiotyki słabo dyfundują w agarze, różnica w strefach

zahamowania dla bakterii wrażliwych i opornych jest niewielka, co może prowadzić do

nieprawidłowego określenia lekooporności (glikopeptydy, polimyksyna B).

Wrażliwy „ S” – wrażliwość drobnoustroju na standardowe dawki leku, wysokie prawdopodobieństwo

sukcesu klinicznego

Średnio wrażliwy „I”– szczepy w zakresie MIC pomiędzy wrażliwym a opornym, sukces

terapeutyczny niepewny, może być osiągnięty, gdy lek jest zagęszczany (np. w drogach moczowych)

lub może być stosowany w większej dawce (np. przy niskiej toksyczności)

Oporny „R”– wysokie prawdopodobieństwo niepowodzenia terapeutycznego, niezależnie od dawki

leku i lokalizacji infekcji

Oznaczanie lekooporności metodą krążkowo-dyfuzyjną:

Materiały:

podłoże agar Mueler- Hinton (MHA)

1 ml jałowej 0,85% soli fizjologiczna (NaCl)

krążki bibułowe z antybiotykiem

zawiesina bakteryjna

wzorzec skali

jałowe wymazówki

Wykonanie:

1. Przygotować inoculum - kilka tych samych kolonii bakterii ze świeżej, 18-godz. hodowli

bakterii zawiesić w jałowym fizjologicznym roztworze NaCl (0,85%) celem uzyskania zawiesiny o

gęstości 0,5 w skali McFarlanda, co w przybliżeniu odpowiada liczbie od 1-2 10 8 c.f.u./ml. Gęstość

zawiesiny oznaczyć nefelometrycznie przy użyciu kolorymetru

2. W ciągu 15 min. zanurzyć w inoculum jałową wymazówkę. Usunąć nadmiar zawiesiny,

obracając i przyciskając wymazówkę mocno do ściany probówki powyżej poziomu płynu. Zawiesinę

trzykrotnie rozprowadzić na całej powierzchni podłoża, przekręcając płytkę za każdym razem o 60°C

3. Po wyschnięciu (do 15 min.) na posiane podłoże nałożyć krążki z antybiotykami (za

pomocą sterylnej pęsety lub z zastosowaniem szablonu, co ułatwia równomierne rozmieszczenie

krążków). Każdy krążek należy delikatnie przycisnąć, zapewniając równomierny kontakt z podłożem.

4. W ciągu 15 min. płytki wstawić do cieplarki, inkubować w warunkach tlenowych 16-18

godzin, w temp. 35 C.

5. Zmierzyć średnicę każdej strefy zahamowania wzrostu drobnoustroju (wliczając średnicę

krążka) i zanotować odczyt w mm. Pomiaru stref można dokonać za pomocą linijki lub suwmiarki.

6. Interpretacja wyniku - wg rekomendacji.

Czynniki wpływające na wielkość strefy zahamowania wzrostu w metodzie krążkowo-

dyfuzyjnej.

Gęstość inoculum – w przypadku zbyt małej gęstości inoculum strefa zahamowania, niezależnie od

wrażliwości mikroorganizmu będzie mniejsza - oporne szczepy mogą zostać opisane jako wrażliwe.

Przy zbyt dużej gęstości inoculum , wielkość uzyskanej strefy będzie mniejsza - szczepy wrażliwe

mogą zostać opisane jako oporne.

Czas nałożenia krążków – na posianych płytkach pozostawionych w temperaturze pokojowej dłużej

niż podano, przed nałożeniem krążków dochodzi do namnażania szczepów – w efekcie strefy

zahamowania wzrostu mogą być mniejsze i szczepy mogą zostać opisane jako oporne.

Temperatura inkubacji – w celu otrzymania optymalnego wzrostu, podłoża z antybiogramem należy

inkubować w 35°C. Jeśli temperatura jest niższa, wydłuża się czas inkubacji, a uzyskane strefy są

większe.

Czas inkubacji – większość metod uwzględnia 16-18 godzinny okres inkubacji. W wyjątkowych

sytuacjach wstępny wynik może być odczytany po 6 godzinach, nie mniej wynik należy potwierdzić

po odpowiednim czasie inkubacji.

Rozmiar płytek, grubość warstwy podłoża agarowego i rozmieszczenie krążków z antybiogramem –

na płytkach o średnicy 9-10 cm umieszcza się nie więcej niż 5 krążków. Na bardzo cienkich podłożach

może wytwarzać się większa strefa zahamowania, odwrotnie przy zbyt grubym podłożu. Właściwe

rozmieszczenie krążków zapobiega nakładaniu się stref zahamowania lub powstawaniu zniekształceń

przy brzegach płytki.

Stężenie antybiotyków w krążkach – średnica strefy zahamowania zależy od zawartości antybiotyku w

krążku. Krążki wymagają odpowiedniego przechowywania, zgodnie z instrukcją.

Skład podłoża – jest ściśle ustalony; podłoże wpływa na wielkość strefy, decydując o stopniu wzrostu,

współczynniku dyfuzji i aktywności leku.

Kontrola jakości

Precyzja i dokładność metody powinny być monitorowane za pomocą programu kontroli jakości.

Okresowo (raz w miesiącu, przy nowej serii krążków) przeprowadza się kontrole wrażliwości dla

szczepów kontrolnych o znanej lekowrażliwości. Uzyskiwanie wyników, które nie mieszczą się w

określonym zakresie, jest przypuszczalnie efektem błędu technicznego lub użycia niewłaściwych

odczynników. Należy sprawdzić każdy odczynnik i etap testu, odnaleźć i wyeliminować błąd.

2. Metody rozcieńczeniowe – pozwalają na określenie minimalnego stężenia antybiotyku (MIC –

minimum inhibitory concetration) hamującego wzrost bakterii. Seryjne rozcieńczenia antybiotyku

przygotowuje się w podłożu płynnym lub podłożu agarowym, do których następnie dodaje się

odpowiednie inoculum i inkubuje. Metody pracochłonne, wykorzystywane głównie w badaniach

naukowych.

W niektórych gotowych systemach (ręczne, automatyczne) stosowane są metody półilościowe.

Określa się w nich hamowanie wzrostu bakterii na 2 lub 3 stężenia krytyczne (ang. breakpoint –

wartość graniczna - określona wartość MIC lub wartość strefy zahamowania wzrostu wokół

antybiotykiem kwalifikująca szczep jako: S, I, R) dla stopni wrażliwości S, I, R.

Metodę dodawania leku do pożywki (można przygotować jedno lub dwa stężenia) wykorzystuje się do

określenia wrażliwości na antybiotyki i chemioterapeutyki drobnoustrojów wolno rosnących na

podłożach sztucznych np. prątki gruźlicy.

3. Etest – łączy dyfuzję antybiotyku w agarze i ilościowe określenie stężenia hamującego – MIC.

Wykorzystuje się paski nasycone antybiotykiem w gradiencie stężeń.

Aktualne rekomendacje (2009) doboru krążków i testów do oznaczania wrażliwości bakterii na

antybiotyki i chemioterapeutyki na stronie:

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: