Metody stosowane w diagnostyce autoimunologicznej.doc

Metody stosowane w diagnostyce autoimunologicznej:

-          Metoda immunofluorescencji

-          Immunodyfuzja

-          Immunoblot

-          ELISA

-          Inne: - koagulometryczne

            - nefelometryczne

            - chemiluminescencyjne

Metoda immunofluorecsencji

Technika wprowadzona 40 lat temu, wciąż jest podstawową techniką immunologiczną. Charakteryzuje się wysoką czułością i swoistością . W metodzie tej żródłem natywnych       ( niezmienionych) antygenów są substraty tkankowe pozwalajace na wykrycie przeciwciał.

   Dwa podstawowe warianty IF:

   - Metoda bezpośrednia DIF ( do wykrywania immunoglobulin i dopełniacza)

   - Metoda pośrednia IIF ( do wykrywania przeciwciał krążących)

Immunodyfuzja

Jest metodą pomocniczą przy wykrywaniu przeciwciał precypitujacych skierowanych przeciwko rozpuszczalnym antygenom jądrowym. Należą do nich nRNP, Sm, Ro, La, Scl-70.

Immunoblot

W tej metodzie otrzymuje się rozdział poszczególnych antygenów. Umożliwia dokładne określenie podjednostki antygenów, z którymi łączą się przeciwciała.  

ELISA

Testy oparte na metodach immunoenzymatycznych ( Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) dają wyniki ilościowe. Metoda ta nie wystarcza do oceny przeciwciał przeciwjądrowych, należy więc po niej przeprowadzić test immunofluorescencji.  

Najważniejsze grupy autoprzeciwciał:

Przeciwciała przeciwjądrowe i przeciwcytoplazmatyczne:

Przeciwciała przeciwjadrowe ( ANA- Anti Nuclear Antibodies) obejmują heterogenną grupę przeciwciał skierowanym przeciw różnym antygenom zarówno jądrowym jak i cytoplazmatycznym. Podstawowe typy fluorescencji jadrowej:

-          Homogenny   - obwodowy    - jaderkowy

-          Drobnoziarnisty   - gruboziarnisty

-          Antycentromerowy

Podstawowe rodzaje przeciwciał przeciwjadrowych:

•        dsDNA – marker ciężkich postaci tocznia trzewnego (SLE) , a w szczególności jego postaci z zajeciem nerek

•        Histonowe- obecne w toczniu indukowanym lekami ( szczególnie prokainamidem i hydralazyną), rzadko w SLE bez etiologii polekowej, wystepują także w reumatoidalnym zapaleniu stawów

•        U1-nRNP- marker mieszanej choroby tkanki łącznej ( MCTD) i SLE o łagodnym przebiegu

•        Ro ( SS-A)/La (SS-B) - obecne w różnych postaciach tocznia, w Zespole Sjogrena, i w twardzinie układowej

•        Sm- marker ciężkich postaci tocznia, często z zajęciem układu nerwowego

•        Scl-70 – marker twardziny układowej

•        ACA ( przeciwciała antycentromerowe) – marker łagodnej postaci twardziny, Zespołu CREST

•        Jo-1 – marker zapalenia wielomięsniowego ( polymyositis)

•        U3- nRNP ( fibrylarynowe)- obecne w twardzinie układowej

•        RNA- polimereza I – obecna w twardzinie układowe, PM-Scl wystepują w zespołach nakładania

•        PCNA ( cyklinowe)- wystepują w toczniu układowym trzewnym, Ku obecne w toczniu układowym, twardzinie, w zespołach nakładania

•        Mi-1 i Mi-2n – wystepują w zapaleniu skórno-mięśniowym ( dermatomyositis)

•        Antyrybosomalne- obecne w toczniu z zaburzeniami psychicznymi

•        AnuA- wystepują w toczniu trzewnym, wykorzystywane są do różnicowania tocznia trzewnego od twardziny układowej

Przeciwciała wykrywane w zapaleniach naczyń (vasculitis):

•        Przeciwciała przeciw antygenom cytoplazmy neutrofilów ( ANCA). Wyróżnia się ich dwa podstawowe typy:

•        Cytoplazmatyczny (cANCA): związany z Ziarnikowatością Wegenera, chorobą Crohna, Churg-Straussa, polyateritis nodosa. Antygenem reagującym z surowicą pacjenta jest proteinaza 3 znajdująca się w cytoplazmie granulocytów.

•        Perinuklearny ( pANCA): związany z innymi zapaleniami naczyń, np.. Polyangitis microscopica i niekiedy z innymi chorobami: glomerulonephritis czy colitis ulcerosa. Antygenami reagującymi z surowicą pacjenta są mieloperoksydaza, elastaza, laktoferyna, lizozym lub katepsyna G dyfundujące do błony jądrowej granulocytów.

Przeciwciała wykrywane w Zespole antyfosfolipidowym (APS):

W diagnostyce APS w pierwszej kolejności należy wykonać oznaczenia obecności przeciwciał antykardiolipinowych w klasach IgM i IgG i antykoagulantu toczniowego. Zgodnie z najnowszą definicją zespołu antykardiolipinowego ( kryteria Sydney) w przypadku wyników ujemnych powinno się dodatkowo oznaczyć przeciwciała przeciw B2 – glikoproteinie I, by ostatecznie wykluczyć APS. W sytuacjach nieoznaczalnych , które wymagają dalszej diagnostyki można dodatkowo oznaczyć przeciwciała przeciw: protrombinie, fosfatydyloserynie i fosfatydyloinozytolowi.

Antykoagulant toczniowy ( LA )

•        Jest to heterogenna grupa przeciwciał antyfosfolipidowo- białkowych, które in vitro przedłużąją czasy krzepnięcia osocza zależne od fosfolipidów. Obserwuje się przedłużenie czasów krzepnięcia wrażliwych na LA jak APTT (Activated Partial Thrombin Time) lub dRVVT ( dilute Russel Viper Venom Time).

•        Uważa się, że LA najlepiej koreluje z ryzykiem powikłań zakrzepowo-zatorowych. 

Przeciwciała antykardiolipinowe
w klasie IgG i IgM

Są one najczęściej wykonywanymi oznaczeniami w diagnostyce APS. Należy jednak pamietać, że wykluczenie APS wymaga wykonania oznaczenia LA i przeciwciał przeciw B2-glikoproteinie I. Każde badanie przeciwciał antykardiolipinowych z wynikiem dodatnim należy powtórzyć po 12 tygodniach- dopiero dwa wyniki dodatnie uzyskane w odstępie co najmniej 12-tu tygodni dają podstawę do rozpoznania APS. Duże ryzyko powikłań związane jest z występowaniem tych przeciwciał w średnich i wysokich mianach. Wyniki nisko dodatnie traktuje się jako wątpliwe i nie dajace podstaw do rozpoznania APS.

Przeciwciała przeciw β2-glikoproteinie I w klasie IgG i IGM (anty β2-GPI):

Test ten jest mniej czuły w odniesieniu do objawów APS od testu na obecność przeciwciał antykardiolipinowych , natomiast ich korelacja z objawami choroby jest bardziej podobna. 

Przeciwciała przeciw protrombinie w klasie IgG i IgM:

Przeciwciała przeciw protrombinie są drugim najważniejszym kofaktorem przeciwciał antyfosfolipidowych, są w niektórych przypadkach związane ze zjawiskiem LA. Ich korelacja z objawami klinicznymi APS jest słabsza niż w poprzednich dwóch grupach przeciwciał.

Przeciwciała przeciw fosfatydyloinozytolowi w klasie IgG i IgM:

Obecność tych przeciwciał najczęściej współistnieje z obecnością innych przeciwciał antyfosfolipidowych.

Ich obecność wiąże się z tendencją do występowania poronień u kobiet.

Czynnik Reumatoidalny (RF):

•        Jest to autoprzeciwciało skierowane przeciwko domenom CH2 i CH3 regionu Fc immunoglobuliny klasy G ( IgG). Najczęściej występuje on w klasie IgM, ale może być w klasie IgG, IgA lub IgE.

•        Oznaczenia wykonuje się w surowicy, płynie stawowym oraz płynach z jamy osierdzia i jamy opłucnej.

•        RF w niskim mianie stwierdza się u 1-2 % zdrowej populacji

•        Częstość występowania wzrasta wraz z wiekiem

Przyczyny zwiększonego  miana RF i częstość wystepowania:

•        Choroby Reumatyczne:- RZS ( 80-85%) ,SLE ( 15-35%), - twardzina układowa ( 20-30 %) , - mieszana choroba tkanki łącznej ( 50-60%) , - zespól Sjogrena ( 75-95%), Zapalenie wielomięśniowe i skórnomięśniowe ( 5-10%) , - sarkoidoza (15%), - krioglobulinemia (40-100%)

•        Choroby zapalne wątroby, zwłaszcza przewlekłe wirusowe zapalenie

•        Przewlekłe zapalne choroby płuc

•        Nowotwory , zwłaszcza choroby limfoproliferacyjne

•        Zakażenia: wirusowe- AIDS, mononukleoza zakażna, grypa;  bakteryjne: gruzlica, trąd, kiła, salmonelozaa, podostre zapalenie wsierdzia

•        Stan po szczepieniu

Przeciwciało przeciw cyklicznemu cytrulinowanemu peptydowi
( anty-CCP)

•        Oznaczenie wykonuje się metodą ELISA

•        Wykorzystuje się w rozpoznaniu RZS- swoistość 98% największa spośród wszystkich znanych markerów RZS.

•        Uważane za serologiczny marker wczesnej postaci RZS szczególnie u chorych z obecnym RF w klasie IgM

Składowe dopełniacza:

•        Jest to kaskada 30 białek enzymatycznych wytwarzanych przez hepatocyty i monocyty.

•        Bierze udział w reakcji zapalnej i uszkadzaniu komórek.

•        Przyczyną zwiększonego stężenia składowych dopełniacza jest ostry proces zapalny.

Krioglobuliny

•        Typ I- immunoglobuliny monoklonalne, najczęściej klasy  M

•        Typ II- immunoglobuliny monoklonalne klasy M reagujace z poliklonalną immunoglobuliną klasy G, aktywują układ dopełniacza

•        Typ III- immunoglobuliny poliklonalne, zwykle klasy M i G, aktywują układ dopełniacza

•        U zdrowej osoby wynik prawidłowy jest ujemny

•        Choroby w przebiegu których może wystąpić krioglobulinemia:

-  Zakażenia wirusowe, bakteryjne, grzybicze, pasożytnicze ( najczęściej zapalenie wątroby typu C)

- Choroby autoimmunologiczne ( SLE, RZS, guzkowe zapalenie tętnic, Zespół Sjögrena, twardzina układowa, sarkoidoza, plamica Henocha i Schonleina, zapalenie tarczycy, zapalenie wielomięśniowe, choroba Behceta) 

Choroby limfoproliferacyjne ( makroglobulinemia Waldenströma, szpiczak mnogi, białaczki z komórek B- zwłaszcza przewlekła białaczka limfatyczna)

-  Kłębuszkowe rozplemowe zapalenie nerek

- Krioglobuliny typu I występują u 25% chorych najczęściej w przebiegu zespołu limfoproliferacyjnego, a głównym objawem jest zespół nadlepkości krwi

-  Krioglobuliny typu III występują u 50% chorych a ich objawem jest zapalenie naczyń.

Markery osteogenezy

•        Fosfataza zasadowa – krążąca we krwi jest głównie pochodzenia kostnego, pozostała część pochodzi z wątroby, nerek, jelit i łożyska.

•        Przyczyną zwiększonej aktywności ALP jest wzmożona aktywność osteoblastów, upośledzone wydalanie ALP przez drogi żółciowe (żółtaczka zastoinowa) oraz wytwarzanie ALP przez nowotwory

•        Osteokalcyna- białko zależne od witaminy K wytwarzane przez osteoblasty, ondoblasty i chondrocyty

•        Propeptydy prokolagenu typu I

Markery osteolizy

•        Fosfataza kwaśna oporna na hamowanie winianem

•        Produkty degradacji kolagenu

Badania obrazowe

•        Radiografia klasyczna

•        Tomografia komputerowa

•        Rezonans magnetyczny

•        Scyntygrafia

•        Ultrasonografia

Choroby tkanki łącznej a nerki :

•        RZS- białkomocz może pojawić się późniejszym okresie choroby

•        SLE- powoduje objawy zespołu nerczycowego i postępującej niewydolności nerek

•        Toczeń polekowy- cechy kłębuszkowego zapalenia nerek, identyczne jak w SLE należą do rzadkości. W tych przypadkach są obecne p-ANCA, a lekiem wywołującym bywa penicylamina lub dihydralazyna

•        Twardzina układowa – zwykle skąpe i mało charakterystyczne pomimo zaawansowanych zmian w nerkach. Opisywano twardzinowy przełom nerkowy- SRC rozwija się u < 20% chorych z dSSc w 80% przypadków w ciągu pierwszych 4 lat, znacznie rzadziej <2% u chorych z ISSc.

•        Twardzinowy przełom nerkowy objawia się szybko narastającym nadciśnieniem tętniczym niekiedy z silnym bólem głowy, zaburzeniami widzenia, drgawkami, ostrą niewydolnością lewokomorową oraz cechami niewydolności nerek. Może ponadto wystąpić niedokrwistość hemolityczna mikroangiopatyczna.

•        Mieszana choroba tkanki łącznej i zespół nakładania – zespół nerczycowy w przebiegu błoniastego kłębuszkowego zapalenia nerek

•        Ziarniniakowatość Wegenera – ostatecznie u 70% chorych pod postacią kłębuszkowego zapalenia nerek ujawniającego się głównie zmianami w osadzie moczu. Zdarza się postać ograniczona wyłącznie do nerek- samoistne martwicze kłębuszkowe zapalenie nerek mogące przybrać postać gwałtownie postępującego

•        Mikroskopowe zapalenie naczyń- zajęcie nerek u 80-90%, u 2/3 rozwija się niewydolność nerek

•        Zespół Churga- Strauss – kłębuszkowe zapalenie nerek występuje u 85% chorych są zwykle łagodniejsze i związane z obecnością ANCA

•        Choroba Goodpasture´a – obecność przeciwciał przeciwko błonie podstawnej,  powodujących ostre kłębuszkowe zapalenie nerek i krwawienia do pęcherzyków płucnych.

•        Plamica Henocha i Schonleina – występuje najczęściej krwiomocz ponadto krwinkomocz, białkomocz, zwiększone stężenie kreatyniny w surowicy , choroba związana z obecnością złogów IgA. Gdy choroba jest ograniczona wyłącznie do nerek rozpoznajemy Nefropatię IgA.

•        Zapalenie naczyń związane z samoistną krioglobulinemią mieszaną – kłębuszkowe zapalenie nerek z obrzękami obwodowymi i nadciśnienie tętniczym

•        Guzkowe zapalenie tętnic – nadciśnienie tętnicze naczyniowonerkowe, objawy niewydolności nerek, rzadko zawał nerki z silnym nagłym bólem okolicy lędźwiowej

•        Choroba Behceta – nawracające owrzodzenia narządów płciowych prącia i moszny u mężczyzn oraz sromu i pochwy u kobiet

•        Zespól Sjöogrena – głównie zapalenie śródmiąższowe, rzadziej kwasica cewkowa, czasem kamica i upośledzenie czynności nerek

•        ZZSK – białkomocz związany z odkładaniem się złogów amyloidu oraz nefropatią IgA oraz krwinkomocz

•        Reaktywne zapalenie stawów – pęcherzyki, nadżerki, plamki głównie w ujściu cewki moczowej, na żołędzi lub trzonie prącia, niebolesne, nie pozostawiające blizn. Ponadto wyciek z cewki moczowej i bolesne oddawanie moczu, zapalenie stercza, najądrza, pęcherza moczowego, szyjki macicy i pochwy.