BIOCHEMIA
SPRAWOZDANIE
ĆWICZENIE 5
BADANIE AKTYWNOŚCI ENZYMÓW AMYLOLITYCZNYCH
Sabina Spyrka
Natalia Wiśniewska
Biotechnologia II
Gr. 5
OPOLE
WPROWADZENIE:
CEL ĆWICZENIA:
Poznanie wpływu enzymów amylolitycznych (α- i β-amylazy) na skrobię.
PRZEBIEG ĆWICZENIA
CZĘŚĆ I – Przygotowanie homogenatu zbożowego
1. Odważyłyśmy 1 g kiełków jęczmienia.
2. Utarłyśmy je w moździerzu z 5 ml zimnej wody destylowanej
3. Zawiesinę przeniosłyśmy do zlewki o objętości 50 cm3
WYNIKI I WNIOSKI
W wyniku roztarcia kiełków otrzymaliśmy roztwór, w którym bezpośrednio rozpuszczonym enzymem amylazą. Kiełkujące ziarna zbóż zawierają duże ilości tego typu enzymu stąd wykorzystaliśmy do jego uzyskania kiełki jęczmienia.
CZĘŚĆ II – Przygotowanie roztworu skrobi
1. Odważyłyśmy na wadze laboratoryjnej 0,5 g skrobi
2. Utarłyśmy skrobię w moździerzu z 3 cm3 zimnej wody destylowanej, aż uzyskałyśmy gładką zawiesinę
3. Wlałyśmy zawiesinę wąskim strumieniem do 250 cm3 wrzącej wody
4. Gotowałyśmy na grzałce elektrycznej przez 5 minut
5. Następnie studziłyśmy umieszczając probówki z gorącym roztworem w zlewce z zimną wodą
Powyższe kroki miały na celu uzyskanie wodnego roztworu skrobi. Podgrzewanie było konieczne gdyż skrobia jest wielocukrem nierozpuszczalnym w zimnej wodzie. Dla skutecznego wymieszania z zawiesiną zawierającą enzymy musieliśmy uzyskać jednak roztwór skrobi.
CZĘŚĆ III – Hydroliza skrobi przez amylazę słodową
1. Wprowadziłyśmy do 4 kolejno ponumerowanych probówek po 1 cm3 zawiesiny kiełków zbożowych oraz roztworu skrobi (uzyskane w poprzednich etapach)
2. Dodałyśmy natychmiast po sporządzeniu do jednej z probówek 1 kropli roztworu jodu, następnie wymieszałyśmy zawartość probówki.
3. Pozostałe trzy probówki umieściłyśmy w łaźni wodnej w temp. 40 oC
4. Po 3 minutach dodałyśmy kroplę roztworu jodu do drugiej probówki i wymieszałyśmy zawartość.
5. Powtórzyłyśmy te czynności po 10 minutach dla 3 probówki, a po 15 dla probówki 4.
W wyniku doświadczenia otrzymaliśmy różne zabarwienia roztworów w probówkach.
Kolejno: 1 - granatowo-fioletowe (intensywna barwa), 2 – fioletowe, 3 – fioletowo-czerwone,
4 – bezbarawne. Obrazuje to działanie hydrolitycznego enzymu – amylazy - na cząsteczkę polisacharydu - skrobi. Skrobia składa się z dwóch typów polisacharydów – amylozy (20-30%) i amylopektyny (70-80%). Amyloza jest polimerem prawie liniowym zbudowanym z 200 – 2000 reszt glukozy połączonych wiązaniami a-1,4-glikozydowymi. Amyloza nie rozpuszcza się w zimnej wodzie, natomiast w wodzie gorącej dosyć dobrze przechodzi z ziarenek skrobi natywnej do roztworu. Amyloza łatwo ulega hydrolizie w obecności enzymów do maltozy i glukozy. Z jodem tworzy helikalny kompleks o charakterystycznym ciemnoniebieskim zabarwieniu.
Charakterystycznym dla niej enzymem jest amylaza – hydrolityczny enzym. Rozkłada on wiązania a-1,4-glikozydowe -> z polisacharydów złożonych powstają polisacharydy prostsze, w przypadku doświadczenia w końcowej fazie glukoza i maltoza. Roztwory skrobi, pod wpływem wodnego roztworu jodu przyjmują intensywnie niebiesko granatowy kolor. Jest on efektem adsorpcji jodu na cząsteczkach polisacharydu. Proces ten nosi cechy adsorpcji kanałowej, tj. cząsteczki dwuatomowe jodu wnikają do kanałów
utworzonych przez spiralnie zwinięte molekuły cukru, pełniącego w tym przypadku rolę liganda. Na każdy skręt tak utworzonej spirali przypada około 6 reszt monosacharydów wchodzących w skład łańcucha. Oddziaływanie pomiędzy ligandem a kompleksowym jodem ma charakter niekowalencyjny, opiera się głównie na siłach Van der Waalsa i wiązaniach typu przeniesienia ładunku. Molekuły jodu we wnętrzu kanału tworzą łańcuchy wzdłuż których mogą przemieszczać się elektrony. Efektem tej delokalizacji jest silne pochłanianie światła przez powstały kompleks, co prowadzi do intensywnego zabarwienia.
Wyniki tych właściwości obserwowane były w wyniku doświadczenia. Pierwsza probówka jako, że enzym nie miał czasu zadziałać zabarwiła się najintensywniej – skrobia adsorbowała najefektywniej jony jodu. Zawartość 2. probówki, poddana 3 minutowemu działaniu enzymu, zawierała już większą ilość amylodekstryn – związków o mniejszej liczbie monomerów (około 10) – pochłanianie jodu i delokalizacja elektronów, a co za tym idzie pochłanianie światła mniej intensywne – fioletowe zabarwienie roztworu. Kolejna probówka zawierała jeszcze krótsze łańcuchy polisacharydowe – erytrodekstryny – wynik 10 minutowego działania enzymów na skrobię. Zawartość ta z reakcji z jodem przyjęła barwę fioletowo-czerwoną. Probówka z roztworem najdłużej poddawanym działaniu amylazy nie barwił się w reakcji z jodem – zawierał maltozę oraz glukozeę które nie łączą się z jonami jodu, a co za tym idzie nie dają odczynu barwnego.
biobird