TECHNIKA SOUTHERN(2).pdf

TECHNIKA SOUTHERN

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab1.html

TECHIKA SOUTHER

(DNADNA) hybrydyzacja DNA w celu identyfikacji określonego fragmentu DNA.

Etapy :

1. Izolacja i oczyszczanie DNA z komórek lub tkanek.

Jeżeli musimy wyizolować DNA z tkanki lub organizmu pierwszym etapem będzie

homogenizacja czyli roztarcie na jednolitą masę. Nie jest to konieczne gdy materiałem

są komórki w roztworze np. bakterie w pożywce czy krew. Następne etapy są na ogół

dość podobne. Obejmują cykl dodawania różnych roztworów (np. lizozymu enzymu

niszczącego ściany komórkowe w przypadku bakterii , detergentów destabilizujących

błony komórkowe itp.) , wielokrotnego wirowania a także jeśli zachodzi potrzeba

podczyszczania preparatu z białek (np. denaturacja przy użyciu fenolu) i RNA (np.

wytrącanie octanem amonu i trawienie RNazą).

2. Trawienie DNA odpowiednimi restryktazami.

3. Rozdział elektroforetyczny fragmentów

DNA według wielkości i ich denaturacja IN

SITU. Po rozdziale na żelu DNA zostaje

zdenaturowany pod wpływem NaOH a

następnie poddaje się go działaniu roztworu

neutralizującego o pH 7,4.

4. Przeniesienie fragmentów DNA z żelu na

1 z 3

2010-04-04 13:28

TECHNIKA SOUTHERN

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab1.html

filtr nitrocelulozowy lub nylonowy z

zachowaniem ich charakterystycznego

rozmieszczenia. Umożliwia to siła ssąca

bibuły przy transferze kapilarnym. Możliwy

jest także elektrotransfer. Następnie DNA

zostaje związany z filtrem przez zapiekanie w

80°C lub przez naświetlanie UV.

5. Hybrydyzacja z sondą.

a. Prehybrydyzacja polega na moczeniu

filtru w odpowiednim roztworze , którego

składniki blokują miejsca mogące związać

kwasy nukleinowe na filtrze. Nylon i

nitroceluloza , z których produkuje się filtry

mają wysokie powinowactwo do

jednoniciowego DNA czy RNA. Po

przeniesieniu badanego materiału jest to już

cecha niekorzystna. W celu

zminimalizowania tła wynikającego z

hybrydyzacji sondy do losowych cząsteczek

DNA lub RNA dodaje się również

niehomologiczne DNA nośnikowe. Od tego

etapu uzależniona jest czułość i

specyficzność eksperymentu. Eliminuje

niespecyficzne tło. Warunki prehybrydyzacji

stężenie soli , temperatura są takie same

jak właściwej hybrydyzacji.

b. Właściwa hybrydyzacja w tym właśnie

etapie wyznakowana sonda wiąże się z

unieruchomionymi na filtrze kwasami

nukleinowymi. Dobranie odpowiednich

warunków zapewnia specyficzność czyli

wiązanie sondy tylko z określonymi

fragmentami oraz czułość. W przypadku gdy

mamy 100% lub dość wysoką homologię

stosujemy ostrzejsze warunki : wyższą

temperaturę (65°C) , mniejsze stężenie soli ,

czasami dodatek formamidu. Gdy homologia

jest częściowa , wymagane są mniej ostre warunki : niższa temperatura (55°C) ,

wyższe stężenie soli. Sondę przed dodaniem należy zawsze zdenaturować w wysokiej

temperaturze ponieważ musi być ona w postaci jednoniciowej , co umożliwi jej

związanie na filtrze.

c. Płukanie filtru pozwala na usunięcie niezhybrydyzowanej sondy co jest

warunkiem specyficznego obrazu hybrydyzacji.

2 z 3

2010-04-04 13:28

TECHNIKA SOUTHERN

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab1.html

6. Ustalenie położenia fragmentów , do których zhybrydyzowała sonda z użyciem

autoradiografii , reakcji barwnych lub fluorescencji.

RÓŻNE TECHNIKI CZYLI TRZY ŁYKI PRAKTYKI

TECHNIKA NORTHERN

3 z 3

2010-04-04 13:28

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: