Instytut Biochemii Technicznej PŁ
Mikrobiologiczna degradacja i transformacja organicznych związków aminowych.
Procesy biodegradacji i detoksykacji obcych dla środowiska naturalnego substancji, czyli ksenobiotyków, nabrały obecnie szczególnie dużego znaczenia w związku z jego daleko posuniętym chemicznym zanieczyszczeniem. Na długiej liście szczególnie uciążliwych i groźnych ksenobiotyków czołowe miejsca zajmują pochodne azotowe związków organicznych. Substancje te używane są w znacznych ilościach w rolnictwie jako herbicydy i insektycydy oraz produkowane w skali przemysłowej jako składniki surfaktantów, farb, farmaceutyków, rozpuszczalników i innych. Alifatyczne, alicykliczne i aromatyczne pochodne aminowe są reprezentowane jako ważne frakcje tych chemikaliów. Ponadto, rozpatrując kompleksowo biodegradację pochodnych azotowych związków organicznych można przyjąć, że w wielu przypadkach centralną rolę w ich przemianach pełnią pochodne aminowe, do których są one przejściowo transformowane.
Poznanych zostało wiele różnorodnych mechanizmów enzymatycznych przemian amin, przebiegających z udziałem mikroorganizmów. Część z nich prowadzi tylko do częściowego przekształcenia struktury chemicznej tych związków, znane są też reakcje biochemiczne związane z pełną ich mineralizacją [1]. Niektóre ksenobiotyki będące pochodnymi aminowymi związków organicznych (np. z klasy pestycydów) relatywnie odporne są jednak na działanie mikroorganizmów [2].
Praca ma na celu przedstawienie dotychczasowych ustaleń dokonanych w badaniach laboratoryjnych nad enzymatycznymi mechanizmami mikrobiologicznej biodegradacji i biotransformacji pochodnych aminowych związków alifatycznych (w tym, z grupą aminową w łańcuchu bocznym związków aromatycznych), alicyklicznych oraz aromatycznych (głównie pochodnych aniliny).
Pochodne alifatyczne (głównie aminokwasy i aminy) są względnie łatwo biodegradowalne. Enzymy inicjujące ich biodegradację należą do podklasy EC 1.4. - a więc są to oksydoreduktazy działające na związki z grupą –CH2-NH2 [3]. W dostępnej literaturze [4-6] szeroko opisane są szlaki metabolizmu aminokwasów, dlatego w tym opracowaniu ograniczono się do wskazania tylko kilku enzymów inicjujących te procesy. I tak, deaminację alaniny (rys. 1) katalizuje dehydrogenaza alaninowa (EC 1.4.1.1.).
Rys. 1 Deaminacja alaniny u bakterii z rodzaju Bacillus
Powyższa reakcja, przebiegająca dwukierunkowo (włączenie azotu w obieg komórkowy i deaminacja alaniny), jest typowa dla bakterii z rodzaju Bacillus [7]. U zdecydowanej większości organizmów żywych podobną rolę odgrywa dehydrogenaza glutaminianowa (EC 1.4.1.2.) [4,6]. Jednakże proces deaminacji aminokwasów u drobnoustrojów przebiega głównie z udziałem oksydazy L‑aminokwasów (deaminującej) - EC 1.4.3.2. [6,8]:
Rys. 2. Deaminacja aminokwasów z udziałem oksydazy aminokwasów (deaminującej)
Alkiloaminy są deaminowane przez oksydazę monoaminową [9-11] (oksydaza aminowa zawierającą FAD - EC. 1.4.3.4. [3]) lub przez oksydazę diaminową [10,12-13] (oksydaza aminowa zawierająca miedź – EC 1.4.3.6. [3]). Przebieg reakcji katalizowanej przez oba enzymy jest podobny (rys.3):
Rys. 3. Deaminacja monoamin z udziałem oksydazy monoaminowej
R1 = alkil lub aryl; R2 = H lub alkil
Rys. 4. Deaminacja amin z udziałem dehydrogenaz
Oksydaza monoaminowa (znaleziona min. u Sarcina lutea [11]) wykazuje dość szeroką specyficzność i działa na aminy I, II i III-rzędowe. Oksydaza diaminowa (znaleziona min. u Aspergillus niger i Trichosporon sp. [12-13]) atakuje aminy I rzędowe, diaminy oraz histaminę i stąd znana jest również pod nazwą histaminazy [3,10]. U niektórych drobnoustrojów (np. Pseudomonas sp. AM1 [10,14]) podobną rolę, jak oksydaza monoaminowa, odgrywa dehydrogenaza aminowa (EC. 1.4.99.3.). Jej odpowiednikiem dla amin z aromatycznym rodnikiem przyłączonym do łańcucha alkilowego (rys.4) jest dehydrogenaza aralkilaminowa (EC 1.4.99.4.) [3]:
Cykloheksyloamina (kancerogenna dla człowieka, stosowana jako jednostka budulcowa insektycydów lub jako antyseptyk w przemyśle) jest atakowana w pierwszej kolejności przez oksydazę cykloheksyloaminową (EC 1.4.3.12.) znalezioną m.in. u Brevibacterium oxydans IH‑35A [15], która utlenia ją z jednoczesną deaminacją do cykloheksanonu (rys.5), a ten dalej przekształcany jest kolejno poprzez 6-heksanolakton, kwas 6-hydroksyheksanowy do kwasu adypinowego (co jest typowe dla szlaku biodegradacyjnego cykloheksanolu [16-17]).
Rys. 5. Inicjacja biodegradacji pochodnych aminowych cykloheksanu
Biodegradacja i transformacja aryloamin (w tym głównie aniliny i jej pochodnych) jest dużo bardziej zróżnicowana, aniżeli amin alifatycznych i alicyklicznych.
3-Hydroksyantranilan oraz 2-aminofenol i jego niektóre pochodne ulegają biodegradacji przez bezpośrednie rozszczepienie pierścienia w wyniku działania swoistych dioksygenaz.
Rys. 6. Inicjacja biodegradacji 3-hydroksyantranilanu
3,4-dioksygenaza 3-hydroksyantranilanowa (EC 1.13.11.6.) jest enzymem poznanym już w latach 50-tych [18-20]. W wyniku jej działania z 3-hydroksyantranilanu powstaje semialdehyd 2-amino-3-karboksymukonowy (rys.6), który przy udziale dekarboksylazy semialdehydu aminokarboksymukonowego (EC 4.1.1.45.) ulega przekształceniu do semialdehydu 2‑aminomukonowego [21] (dalsze losy tego związku pokazano poniżej – rys.7).
Natomiast badania nad 1,6-dioksygenazą (roboczo nazwaną 2‑aminofenolową) są w toku. Enzym ten rozszczepia 2-aminofenol przekształcając go w semialdehyd 2-aminomukonowy (rys.7) [22-26].
W hodowlach Pseudomonas arvilla [27] oraz w warunkach beztlenowych lub w przypadku braku NAD [22,25] z powstałego semialdehydu spontanicznie powstaje kwas pikolinowy i jest to prawdopodobnie ślepa uliczka procesu biodegradacji.
U Pseudomonas pseudoalcaligenes JS45 [22,24-25] oraz u Comamonas sp. JS765 [26] semialdehyd 2-aminomukonowy utleniany jest w obecności NAD do 2-aminomukonianu. Ten w procesie hydrolitycznej deaminacji (według He i Spain`a [24,28] katalizowanym przez deaminazę 2-aminomukonową) transformowany jest do kwasu 2-hydroksymukonowego. Dalsze przemiany kwasu 2-hydroksymukonowego są typowe dla ekstradiolowego szlaku biodegradacji katecholu (meta rozszczepienie pierścienia aromatycznego - rys.7) [29-30]. Pirogronian i aldehyd octowy są końcowymi metabolitami tego szlaku. Wyniki badań sugerują [22,28], że powyższa droga biodegradacji 2-aminofenolu funkcjonuje także w przypadku drobnoustrojów wyizolowanych z zanieczyszczonych wód gruntowych.
Rys. 7. Szlak biodegradacji 2-aminofenolu
Najczęściej jednak inicjacja biodegradacji aryloamin związana jest z eliminacją grupy ‑NH2 przez hydroksylację pod działaniem oksygenaz.
Kwas 4-aminobenzoesowy (jeden z komponentów kwasu foliowego, rozpatrywany zazwyczaj w kategorii metabolitów pośrednich, a nie ksenobiotyku) transformowany jest przez monooksygenazę niespecyficzną, znaną również pod nazwą 4‑monooksygenazy arylowej – EC 1.14.14.1. - do kwasu 4-hydroksybenzoesowego (rys. 8) [3]. Warto w tym miejscu wspomnieć, że inny enzym – 1-monooksygenaza 4-aminobenzoesanowa (EC 1.14.13.27.) znaleziona u Agaricus bisporus [31] – katalizuje dekarboksylatywną hydroksylację tegoż 4‑aminobenzoesanu do 4‑hydroksyaniliny (rys.9) [32-33]. Pochodne tego ostatniego związku wykazują aktywność biologiczną i znajdowane są w wysokich stężeniach m.in. w pieczarce oraz u Agaricus bisporus [33].
Rys. 8. Deaminacja kwasu 4-aminobenzoesowego przez hydroksylację z udziałem niespecyficznej monooksygenazy
Rys.9.Dekarboksylatywna hydroksylacja 4-aminobezoesanu do 4-hydroksyaniliny
Kwas antranilowy jest jednym z ważniejszych aromatycznych związków azotowych w metabolizmie zwierząt i mikroorganizmów [34]. Jego estry (metylowy, etylowy), o zapachu pomarańczy, stosowane są w przemyśle kosmetycznym i spożywczym [35]. U bakterii, pod działaniem 1,2-dioksygenazy antranilanowej (dekarboksylująco-deaminującej) – EC 1.14.12.1., antranilan jest przekształcany bezpośrednio do katecholu (rys. 10A) [36-38]. Ta dioksygenaza wprowadza dwa atomy tlenu do substratu z jednoczesną jego dekarboksylacją i deaminacją [39]. Mechanizm reakcji katalizowanej przez ten enzym pochodzący z Pseudomonas fluorescens ATCC 11250 podali Taniuchi i wsp. [37].
W grzybach inicjacja degradacji antranilanu polega na jego transformacji do kwasu 2,3‑dihydroksybenzoesowego i dalej, na drodze dekarboksylacji, przekształceniu w katechol (rys. 10B) [40-42]. Pierwszą z tych reakcji katalizuje 3-monooksygenaza antranilanowa (deaminująca) - EC 1.14.13.35), znaleziona m.in. u Aspergillus niger [40,42-44], Trichosporon cutaneum [41] i Claviseps paspali [45]. Dekarboksylację kwasu 2,3-dihydroksybenzoesowego do katecholu katalizuje dekarboksylaza o-pirokatechanowa (EC 4.1.1.46) [46-48].
Rys.10 Inicjacja biodegradacji antranilanu: (A) - u bakterii; (B) - u grzybów
Warto odnotować, że kwas 2,3-dihydroksybenzoesowy może być również dalej degradowany poprzez bezpośrednie rozszczepienie pierścienia. U Pseudomonas fluorescens 23D-1 (w komórkach którego nie stwierdzono obecności dekarboksylazy o-pirokatechanowej) reakcję katalizuje 3,4-dioksygenaza 2,3-dihydroksybenzoesanowa (EC 1.13.11.14) [49], a w liściach Tecoma stans 2,3-dioksygenaza 2,3-dihydroksybenzoesanowa (EC 1.13.11.28) [50].
Z punktu widzenia ochrony środowiska na szczególną uwagę, spośród omawianej grupy organicznych związków azotowych, zasługuje biodegradacja aniliny (często używanej przy produkcji barwników, tworzyw sztucznych, materiałów wybuchowych i leków [51]) i jej pochodnych.
Należy w tym miejscu wyraźnie zaznaczyć, że pełny szlak biochemicznej degradacji aniliny nie został dotychczas jednoznacznie określony, pomimo że związek ten dla kilku opisywanych szczepów bakteryjnych [52-58] stanowił jedyne źródło węgla, azotu i energii. I tak, nie udało się określić enzymu inicjującego proces biodegradacji tego ksenobiotyku. Na podstawie wielu pośrednich danych (enzym zużywa 2 atomy tlenu, w wyniku reakcji pojawia się katechol i wydzielany jest amoniak [54-55,59]), a także porównania z innymi poznanymi szlakami biodegradacji aromatycznych pochodnych można wszakże przypuszczać, iż jest to 1,2‑dioksygenaza deaminująca.
Z dotychczasowych doniesień wiadomo, że anilinę degradują m.in. szczepy: Rhodococcus erythropolis [53], Nocardia sp. [54,60], Bacillus subtilis [61], Alcaligenes faecalis [55,62] oraz niektóre szczepy bakterii z rodzaju Pseudomonas: Ps. multivorans [56,63], Ps. putida [57,64], Ps. acidovorans [65] i Ps. sp. [58,60],
Wallnöfer i Engelhardt [60] podają, że u Nocardia sp. AM44 oraz Pseudomonas sp.S9 anilina na drodze dioksygenacji zostaje przekształcona do katecholu.
Podobnie w innych badaniach [56,63] stwierdzono, że wyizolowany z próbki ziemi leśnej szczep Pseudomonas multivorans An 1 (wykorzystujący anilinę jako źródło węgla i energii) degraduje ją do katecholu. Ten ulega następnie rozszczepieniu w pozycji orto- (rys.11), dając kwas mukonowy. Dalsze losy tego związku u badanych bakterii nie są jeszcze ustalone.
Wykorzystywanie aniliny przez Pseudomonas multivorans ...
morcys1