B-galaktozydaza.pdf

(1872 KB) Pobierz
Microsoft Word - Biologia molekularna_komentarz_2006.doc
Zakład Biologii Molekularnej UW
BIOLOGIA MOLEKULARNA 2006/2007 wersja 2.0
IZOLACJA REKOMBINOWANEGO ENZYMU Z
KOMÓREK BAKTERII ESCHERICHIA COLI
Celem ćwiczenia jest oczyszczenie rekombinowanego enzymu z bakterii Escherichia coli
β-galaktozydazy (EC 3.2.1.23), produktu genu lacZ z operonu laktozowego ( lac ). Enzym ten został
zmodyfikowany przez dodanie na N-końcu jego cząsteczki peptydu składającego się z sześciu histydyn
oraz epitopu HA (fragment białka hemaglutyniny wirusa grypy), rozpoznawanego przez przeciwciała
anty-HA i składającego się z dziewięciu aminokwasów (YPYDVPDYA), na jego C-końcu (Rys. 1).
Teoretyczna masa cząsteczkowa tego rekombinowanego białka wyliczona na podstawie
znajomości jego sekwencji aminokwasowej wynosi 120980 Da (przy założeniu, że żaden z jego 1066
aminokwasów nie jest usunięty, ani też białko nie ulega modyfikacjom, polegającym na przyłączeniu
jakiejkolwiek dodatkowej reszty, np. cukrowej, fosforanowej, acylowej lub prenylowej).
Rysunek 1. Schemat rekombinowanej β-galaktozydazy.
CHARAKTERYSTYKA SYSTEMU EKSPRESYJNEGO
Sekwencja nukleotydowa DNA kodująca czyszczone białko znajduje się na plazmidzie pET-28a
( Novagen , Rys. 2), który został wprowadzony do komórek bakterii E. coli , szczepu BL21(DE3) 1 .
Plazmidy z serii pET zawierają sekwencję ori typu ColE1 (pochodzącą z pBR322) i stąd występują w
liczbie ok. 40 kopii na pojedynczą komórkę. Gen kodujący białko znajduje się w nich pod kontrolą
promotora dla polimerazy RNA z faga T7 2 . Użyty szczep bakterii posiada, wbudowany do swojego
chromosomu, genom faga λ (forma profaga), zawierający dodatkowo gen kodujący polimerazę RNA z
faga T7, pod kontrolą negatywną promotora z operatorem wiążącym represor laktozowy (tzw. lizogen
λ DE3 3 ). Dodatkowo, użyte bakterie są pozbawione dwóch endogennych proteaz (posiadają mutacje w
genach lon i ompT ), co sprzyja osiągnięciu wyższej wydajności przy produkcji i oczyszczaniu białka.
1/32
29669173.001.png
Zakład Biologii Molekularnej UW
BIOLOGIA MOLEKULARNA 2006/2007 wersja 2.0
Rysunek 2. Schemat systemu ekspresji opartego na plazmidzie pET-28a w bakteriach BL21(DE3) (wg Novagen ).
Ten wysokowydajny i ściśle kontrolowany system ekspresji uruchamiany jest przez dodanie do
pożywki syntetycznego induktora 4 - izopropylo-β- D -1-tiogalaktopiranozydu (IPTG, Rys. 3) do końcowego
stężenia 1 mM, kiedy bakterie osiągną fazę wzrostu wykładniczego (wartość pomiaru zmętnienia
zawiesiny bakterii techniką turbidometrii przy długości fali świetlnej 600 nm - A 600nm ok. 0.8). IPTG, po
2/32
29669173.002.png
Zakład Biologii Molekularnej UW
BIOLOGIA MOLEKULARNA 2006/2007 wersja 2.0
dostaniu się do środka komórek bakterii, wiąże się do represora laktozowego, powodując jego
inaktywację (regulacja allosteryczna represora). W efekcie, uruchomiona jest produkcja polimerazy RNA
z faga T7, a następnie β-galaktozydazy, jako jedynego białka, którego gen w tych komórkach jest pod
kontrolą promotora dla tej polimerazy. IPTG, choć należy do grupy β-galaktozydów, jest analogiem
substratu nie hydrolizowanym przez β-galaktozydazę, ani przez żaden inny enzym w komórce, ze
względu na obecność atomu siarki w miejsce atomu tlenu w wiązaniu glikozydowym.
W wektorach serii pET znajduje się także sekwencja RBS zapewniająca efektywny start
translacji 5 .
Rysunek 3. Wzór strukturalny izopropylo-β- D -1-tiogalaktopiranozydu (IPTG).
OTRZYMYWANIE LIZATU.
PROBLEM ROZPUSZCZALNOŚCI BIAŁKA
Po czterech godzinach indukcji, bakterie odwirowuje się i ich osad zawiesza w buforze
lizującym (50 mM NaH 2 PO 4 , pH 8.0; 300 mM NaCl; 10 mM imidazol) uzupełnionym PMSF 6 -
nieodwracalnym inhibitorem proteaz serynowych (np. trypsyny i chymotrypsyny) - do końcowego
stężenia 1 mM. Fosforan w tym roztworze zapewnia utrzymanie odpowiedniego pH, zaś chlorek sodu, a
także w pewnym stopniu fosforan, odpowiedniej siły jonowej. Zawiesinę bakterii poddaje się sonikacji
(rozbijaniu ultradźwiękami), a następnie odwirowuje się resztki posonikacyjne, otrzymując klarowny lizat
bakteryjny, zawierający wszystkie rozpuszczalne białka z komórek bakterii.
Inna stosowana łagodna (natywna) metoda otrzymywania białek z komórek bakteryjnych
wykorzystuje trawienie otoczki bakteryjnej lizozymem i dalej lizę komórek przy pomocy szoku
osmotycznego (w buforze hipotonicznym).
Teoretycznie, wysokowydajne systemy bakteryjne pozwalają uzyskać ekspresję
rekombinowanego białka na poziomie nawet 50% wszystkich białek komórkowych. W praktyce jednak,
poziom syntezy zależy od cech biologicznych i fizykochemicznych białka, np. niektóre białka mogą być
toksyczne dla bakterii, hamując wzrost hodowli. W przypadku ekspresji w systemach hetereologicznych
problemem może być także różna częstość wykorzystywania poszczególnych kodonów w komórkach
różnych organizmów 7 .
Osobnym problemem jest rozpuszczalność białka. W wielu przypadkach produkowane białko
ulega akumulacji w formie nierozpuszczalnej, w postaci agregatów nazywanych ciałami inkluzyjnymi.
Takie "wytrącone" białko, po otwarciu bakterii w łagodnych (natywnych) warunkach pozostanie we
3/32
29669173.003.png
Zakład Biologii Molekularnej UW
BIOLOGIA MOLEKULARNA 2006/2007 wersja 2.0
frakcji nierozpuszczalnej. Zarówno poziom ekspresji jak i rozpuszczalność produkowanego białka
można modyfikować zmieniając wektor, szczep bakteryjny lub warunki hodowli.
Wektor może zwiększać rozpuszczalność białka przez umożliwienie dołączenia polipeptydu,
który jest sam łatwo rozpuszczalny lub sekwencji kierującej białko do przestrzeni peryplazmatycznej,
gdzie panują bardziej sprzyjające warunki do fałdowania białek 8 . Rozpuszczalność białek można także
czasami zwiększyć stosując szczepy bakteryjne pozbawione aktywności reduktazy tioredoksynowej
i/lub reduktazy glutationowej (posiadające mutacje w genach, odpowiednio, trxB i/lub gor ), co ułatwia
powstawanie w ich cytoplazmie wiązań dwusiarczkowych w produkowanych białkach, które wymagają
takich wiązań do prawidłowego fałdowania.
Nawet jeśli są formowane ciała inkluzyjne, to zwykle część białka pozostaje w formie
rozpuszczalnej. Dobierając odpowiednio warunki hodowli można próbować zmieniać proporcje frakcji
rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej białka. Ogólna zasada jest taka, że wraz ze spadkiem szybkości
syntezy rekombinowanego białka zwiększa się udział jego formy rozpuszczalnej w ogólnej puli.
Szybkość syntezy można zmniejszyć poprzez: a) obniżenie stężenia IPTG, b) obniżenie temperatury
hodowli i/lub c) hodowlę na podłożu minimalnym w przeciwieństwie do standardowo używanego
podłoża pełnego. Zwiększenie napowietrzania hodowli bakteryjnej w czasie indukcji ekspresji może
także zapobiegać tworzeniu ciał inkluzyjnych.
W celu zoptymalizowania poziomu ekspresji i rozpuszczalności białka można także zmieniać
czas indukcji oraz fazę hodowli bakteryjnej, w której dodawany jest induktor ekspresji.
W sytuacji kiedy produkowane białko, po otwarciu komórek w warunkach natywnych, nadal
pozostaje we frakcji nierozpuszczalnej, to można zastosować procedurę jego izolacji w warunkach
denaturujących. Najczęściej stosuje się w tym celu roztwory do lizy, zawierające 2 - 8 M mocznik lub
3 - 6 M chlorowodorek guanidyny. Jednak, z założenia, przy zastosowaniu czynników denaturujących,
otrzymuje się białko pozbawione swej natywnej struktury przestrzennej. Aby przywrócić aktywność
biologiczną można próbować renaturować białko in vitro , ale wydajność renaturacji zależy od
indywidualnych cech białka i może być bardzo niska. Z tego powodu ekstrakcję w warunkach
denaturujących stosuje się zwykle do pozyskiwania białek do takich celów, które nie wymagają
zachowania struktury przestrzennej, np. przy izolacji antygenów używanych następnie do otrzymania
przeciwciał, zaś unika się jej w przypadku, np. białek enzymatycznych. Z drugiej strony, formowanie ciał
inkluzyjnych może nawet ułatwiać izolację, ponieważ zagregowane białko: a) występuje w wysokim
stężeniu i łatwo można je oczyścić, b) jest chronione przed ewentualną proteolizą oraz c) występując w
formie nieaktywnej, nawet jeśli jest potencjalnie toksyczne, nie hamuje wzrostu bakterii.
Obecność białka we frakcji nierozpuszczalnej nie zawsze oznacza, że tworzone są ciała
inkluzyjne. Hydrofobowe białka mogą wiązać się silnie z błonami bakteryjnymi, a białka obdarzone
silnym ładunkiem elektrycznym – z kwasami nukleinowymi. Zwiększenie rozpuszczalności można
wówczas osiągnąć przez dodanie do buforu lizującego detergentów niejonowych, np. Triton X-100 (w
pierwszym przypadku) lub przez trawienie kwasów nukleinowych nukleazami, np. DNazą I i RNazą A (w
drugim przypadku).
CHROMATOGRAFIA
Chromatografia to grupa technik rozdziału składników mieszaniny (np. białek) przy
wykorzystaniu ich różnic w podziale między dwie nie mieszające się ze sobą fazy, ruchomą i
stacjonarną albo różnic w ich wiązaniu się do odpowiednio dobranego złoża. Przykładem jest
stosowana w tym ćwiczeniu chromatografia powinowactwa do immobilizowanego metalu ( immobilized
metal affinity chromatography - IMAC).
4/32
Zakład Biologii Molekularnej UW
BIOLOGIA MOLEKULARNA 2006/2007 wersja 2.0
Sekwencja aminokwasowa bogata w histydyny, w szczególności zawierająca sześć histydyn
pod rząd, ma zdolność do silnego wiązania kationów metali kolorowych typu Ni 2+ , Co 2+ , Zn 2+ , Cu 2+ .
Wykorzystując obecność w białku, naturalnie występującego lub dodanego metodami inżynierii
genetycznej, rejonu bogatego w histydyny, można je wybiórczo związać ze złożem mającym
unieruchomione tego typu kationy na swojej powierzchni. W ćwiczeniu wykorzystywana jest Ni-NTA
agaroza (kompleks jonów Ni 2+ z kwasem nitrylotrioctowym, związany kowalencyjnie z agarozą, Rys. 4).
Rysunek 4. Budowa złoża Ni-NTA agarozowego (wg Qiagen ).
W celu zwiększenia wydajności wiązania, lizat zawierający czyszczone białko jest mieszany
cały czas ze złożem. Po przepłukaniu złoża, w celu usunięcia białek związanych z nim niespecyficznie,
białko z rejonem bogatym w histydyny można z niego uwolnić wysokim stężeniem imidazolu (100 - 250
mM), związku aromatycznego o budowie podobnej do histydyny (Rys. 5, pierścień imidazolu jest tą
częścią struktury histydyny, która wiąże immobilizowany jon Ni 2+ ). Imidazol konkuruje z białkiem o
wiązanie do Ni-NTA, wypiera je ze złoża, dzięki swojemu wysokiemu stężeniu, pozostawiając na złożu
jony Ni 2+ w kompleksie z imidazolem (imidazol jest także obecny w preparacie uwolnionego białka, z
którego można się go pozbyć, np. przez dializę).
Rysunek 5. Wzory strukturalne (A) histydyny i (B) imidazolu.
5/32
29669173.004.png
Zgłoś jeśli naruszono regulamin