Bakterie Bacillus.pdf

M IKROBIOLOGIA T ECHNICZNA – studia zaoczne

Ćwiczenie 3

część teoretyczna

___________________________________________________________________________

Ć WICZENIE 3: I DENTYFIKACJA I CHARAKTERYSTYKA

BIOCHEMICZNA WYIZOLOWANYCH SZCZEPÓW B ACILLUS

Wstęp

Do rodziny Bacillaceae zalicza się laseczki, ba ogół gramdodatnie zdolne do wytwarzania

przetrwalników o wysokiej oporności na działanie czynników chemicznych i fizycznych.

Należą tu dwa rodzaje: tlenowce Bacillus i beztlenowce Clostridium .

Występowanie

Bakterie rodzaju Bacillus, dzięki możliwości tworzenia przetrwalników, są szeroko

rozpowszechnione w przyrodzie. Zawdzięczają to także zdolnościom adaptowania się do

warunków środowiska i aktywny rozwój w otoczeniu o dużej rozpiętości temperatur, pH

i zasolenia. Można je spotkać w glebie, w wodach słodkich i słonych, mule, osadach wód

powierzchniowych, gorących źródłach, na rożnych częściach roślin, w przewodzie

pokarmowym zwierząt czy psującej się żywności.

Bakterie z rodzaju Bacillus najpospolitsze są w glebie . Występują tu zarówno gatunki

mezofilne, jak i psychrofilne. Zaliczane są do zymogenicznej mikroflory gleby , a

więc w przeciwieństwie do autochtonicznej, ich intensywny rozwój występuje w

przypadku dużego napływu do gleby materii organicznej (np. opad liści w lesie,

nawożenie obornikiem itp.). Uczestniczą w mineralizacji gleby . W przypadku

niekorzystnych warunków mogą penetrować środowisko w poszukiwaniu dostępu do

substancji odżywczych (gatunki urzęsione) lub tworzą endospory. Głównym

przedstawicielem laseczek glebowych jest Bacillus cereus , nieco mniej liczne są B.

licheniformis, B. subtilis, B. pumilus . Są to bakterie o niewielkich wymaganiach

pokarmowych. Bardziej wymagające gatunki ( B. psychrosaccharolyticus, B.

polymyxa, B. macerans, B. azotofixans ) rosną głównie w strefie ryzosfery, korzystając

z substancji odżywczych wydzielanych przez rośliny i odwdzięczając się im

wiązaniem azotu atmosferycznego .

Bakterie występują też w wodzie . W wodach słodkich klimatu umiarkowanego

spotyka się te same gatunki co w glebach, tylko w mniejszych ilościach. W gorących

źródłach, gejzerach i jeziorach o wysokich temperaturach swoją niszę znalazły gatunki

termofilne, które nie rosną w temperaturze poniżej 45ºC ( Bacillus stearothermophilus

i Bacillus thermoruber ). W przybrzeżnych wodach morskich i ujściach rzek

(zwłaszcza zanieczyszczonych) spotyka się bakterie glebowe: B. subtilis i B.

licheniformis . W wodach morskich o dużej czystości rozwija się B. cereus . W wodach

i glebach zasadowych spotyka się laseczki alkalofilne ( B. firmus, B. alcalophilus, B.

lentus ).

Bakterie z rodzaju Bacillus powszechnie występują w ściółce i na martwych

tkankach roślin , aktywnie uczestnicząc w II fazie ich rozkładu ( B. megaterium, B.

cereus, B. mycoides). Bakterie te wydzielają liczne enzymy, w tym rozkładające

biopolimery i pochodne aromatyczne, przyczyniając się do rozkładu martwych

liści drzew bogatych w taniny i ligniny .

Bakterie występujące na powierzchni żywych roślin , często są dostarczycielami

azotu (asymilowanego z powietrza), chronią przed szkodliwymi owadami (wydzielają

δ-endotoksyny), zapobiegają lub hamują rozwój chorób grzybiczych.

__________________________________________________________________________________________

K ATEDRA T ECHNOLOGII F ERMENTACJI I M IKROBIOLOGII T ECHNICZNEJ

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

M IKROBIOLOGIA T ECHNICZNA – studia zaoczne

Ćwiczenie 3

część teoretyczna

___________________________________________________________________________

Niektóre gatunki Bacillus występują w przewodzie pokarmowym zwierząt

uczestnicząc w procesach trawienia. B. coagulans, B. licheniformis, B. circulans, B.

laterosporus, B. pumilus znaleziono w żwaczu przeżuwaczy, gdzie pomagają w

degradacji białek, hemiceluloz, ksylenu, glikozydów.

Morfologia i fizjologia

Bakterie z rodzaju Bacillus są tlenowymi lub względnie beztlenowymi ,

gramdodatnimi laseczkami , często tworzące układy łańcuszkowe. Tworzą cylindryczne,

ruchliwe komórki o przeciętnych długościach 1-3 µm, ale bywają też większe ( Bacillus

meganterium zalicza się do jednych z największych bakterii). Urzęsienie głównie

peritrichalne lub biegunowe . Spotyka się jednak również szczepy nieurzęsione i

nieruchliwe ( B. anthracis ).

Ze względu na kształt i rozmieszczenie przetrwalników w komórce bakterie

rodzaju Bacillus dzieli się na trzy grupy:

- laseczki wytwarzające przetrwalniki o średnicy mniejszej od sporangium, o kształcie

owalnym lub cylindrycznym: B. anthracis, B. cereus, B. megaterium, B. licheniformis,

B. subtilis, B. thuringiensis ,

- laseczki wytwarzające przetrwalniki o średnicy większej od sporangium (komórka

macierzysta ulega rozszerzeniu), o kształcie owalnym lub kulistym: B. macerans, B.

stearothermophilus, B. circulans, B. polymyxa ,

- laseczki wytwarzające duże kuliste endospory o średnicy większej niż komórka

macierzysta, położone terminalnie: B. pasteurii , B. sphaericus.

Wśród bakterii Bacillus znane są gatunki mezofilne, termofilne, psychrofilne , a

nawet psychrotrofowe . Większość dobrze rośnie w temperaturze pokojowej oraz w 37ºC ( B.

licheniformis , B. subtilis ). Gatunki termofilne nie rosną w temperaturze poniżej 45ºC, należą

do nich m.in. Bacillus stearothermophilus i Bacillus thermoruber . Do typowych

zimnolubnych bakterii zalicza się Bacillus macquariensis , B. psychrophilus i B.

psychrosaccharolyticus . Liczne gatunki z rodzaju Bacillus mogą bez wyraźnych zmian

metabolicznych adaptować się do warunków środowiska, np. gatunki mezofilne ( B.

licheniformis , B. subtilis, B. coagulans, B. badius, B. smithii ) mogą rosnąć w temperaturach

sięgających 60-70ºC. Są to tzw. termotolerancyjne laseczki .

Bakterie Bacillus , w zależności od gatunku wymagają do wzrostu środowiska o

różnym pH. Grupa laseczek alkalofilnych ( B. firmus , B. alcalphilus , B. lentus , B. pasteurii )

preferuje pH zasadowe, natomiast B. subtilis , B. coagulans , B. licheniformis , B. circulans , B.

laterosporus , B. pumilus lepiej rosną w pH obojętnym.

Niektóre laseczki są halofilne ( B. globisporus, B. marinus, B. halophilus ).

Metabolizm

Bacillus należą do grupy wybitnie heterogennych chemoorganotrofów. Dobrze rosną

na podłożach bulionowych (wyj. B. larvae ). Na agarze rosną w postaci dużych kolonii o

rozmiarach 3-5 mm. W płynnym bulionie rosną w postaci kożucha lub tworzą zmętnienie w

całej objętości pożywki.

Wymagania pokarmowe są bardzo zróżnicowane gatunkowo. Są gatunki, którym

wystarczają pojedyncze źródła węgla, azotu i energii ( B. cereus, B. licheniformis, B. pumilus,

B. subtilis ), inne potrzebują kompleksowych podłoży z dodatkowymi czynnikami wzrostu

__________________________________________________________________________________________

K ATEDRA T ECHNOLOGII F ERMENTACJI I M IKROBIOLOGII T ECHNICZNEJ

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

M IKROBIOLOGIA T ECHNICZNA – studia zaoczne Ćwiczenie 3

część teoretyczna

___________________________________________________________________________

(witaminy, aminokwasy) np. B. azotofixans, B. macerans, B. polymyxa, B.

psychrosaccharolyticus .

Wykorzystywane do wzrostu substancje organiczne, metabolizowane są w komórkach

Bacillus w procesach tlenowych i/lub fermentacyjnych. U niektórych gatunków tlen, jako

akceptor elektronów, może być zastąpiony przez jony NO 3 - (oddychanie azotanowe u

B. licheniformis ). Niektóre gatunki ( B. polymyxa, B. macerans i B. azotofixans ) mogą wiązać

azot atmosferyczny. Gatunki oddychające beztlenowo przeprowadzają fermentację

sacharydów. B. cereus i B. licheniformis wytwarzają 2,3-butandiol, glicerol, CO 2 i niewielkie

ilości mleczanu oraz etanolu. B. polymyxa i B. macerans rozkładają skrobię i pektyny, przy

czym B. polymyxa daje 2,3-butandiol, CO 2 H 2 i etanol, a B. macerans – etanol, aceton, octan i

mrówczan, CO 2 i H 2 . Właśnie na podstawie produktów fermentacji rozróżnia się

poszczególne gatunki z rodzaju Bacillus . Alkalofilna bakteria B. pasteurii może rozkładać

mocznik (ureaza).

Podczas wzrostu wegetatywnego bakterie Bacillus gromadzą kwasy organiczne

powodując zakwaszanie środowiska nawet do pH 4,0-5,0. Jest to spowodowane tym, że

powstający w glikolizie pirogronian nie jest włączany jako acetylo-CoA do cyklu Krebsa

(niektóre enzymy tego cyklu są zablokowane – represja kataboliczna ), tylko wchodzi w cykl

glioksalowy. Cykl Krebsa jest uruchamiany dopiero w trakcie przygotowania do sporulacji.

W końcowej fazie wzrostu wykładniczego, gdy wyczerpaniu ulegają łatwo przyswajalne

źródła węgla i energii, a komórki zaczynają się przygotowywać do wytworzenia endospor,

odblokowywane są enzymy cyklu Krebsa i acetylo-CoA ulega całkowitemu utlenieniu do

CO 2 . Powstaje też wtedy dużo ATP niezbędnego przy sporulacji. Wtedy też, w warunkach

tlenowych, zostają utlenione nagromadzone wcześniej kwasy organiczne, a pH środowiska

wzrasta.

Chorobotwórczość

Wśród bakterii Bacillus jedynie B. anthracis jest uważany za gatunek silnie

patogenny dla człowieka i innych ssaków (a nawet kręgowców). Endospory tego gatunku, są

bardzo odporne na warunki środowiska i mogą wiele lat oczekiwać w glebie czy wodzie. Ich

przedostanie się do żywności powoduje chorobę zwaną wąglikiem , której śmiertelność wśród

zwierząt sięga 100%. U ludzi – stykających się zawodowo z materiałem pochodzenia

zwierzęcego (szczególnie skóry, wełna, sierść) – choroba ma łagodniejszy przebieg, choć jej

postaci płucna lub jelitowa także mogą przebiegać ciężko i prowadzić do śmierci.

Z B. anthracis blisko spokrewniony jest B. cereus , wywołujący zatrucia pokarmowe, lokalne

infekcje ran, choroby oczu, posocznicę i in. Ze względu na swoje występowanie w glebie,

zatrucia tymi laseczkami są dość powszechne (łatwość przedostania się do produktów

spożywczych, szczególnie niedokładnie umytych owoców, warzyw). Patogenami są także

Bacillus alvei , B. popilliae i B. larvae wywołujące choroby pszczół i chrząszczy.

Pozostałe gatunki uważa się za saprofity , jakkolwiek mogą wywołać infekcje w przypadku

osłabienia organizmu.

Znaczenie dla przemysłu

Względnie tlenowe laseczki z rodzaju Bacillus mogą odgrywać negatywną rolę w

przemyśle spożywczym, powodując psucie się różnego rodzaju produktów

konserwowanych : mięsnych, warzywnych i mlecznych. Najczęściej przyczyną jest B.

licheniformis (produkuje gaz wywołując psucie się konserw połączone z bombażem), a w

konserwach zawierających skrobię B. stearothermophilus (psucie z zakwaszeniem, bez

bombażu puszek). B. coagulans odpowiada za psucie się konserw mlecznych.

__________________________________________________________________________________________

K ATEDRA T ECHNOLOGII F ERMENTACJI I M IKROBIOLOGII T ECHNICZNEJ

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

M IKROBIOLOGIA T ECHNICZNA – studia zaoczne Ćwiczenie 3

część teoretyczna

___________________________________________________________________________

Najważniejszą rolę bakterie z rodzaju Bacillus odgrywają jednak w przemyśle

enzymatycznym . Prawie 60% produkowanych w światowej skali preparatów

enzymatycznych przypada na proteinazy (w tym subtilizyny, enzymu stosowanego do

produkcji środków piorących) i α-amylazy otrzymywane w oparciu o hodowlę bakterii

Bacillus (tab. 1.). W odróżnieniu od bakterii gramujemnych nie posiadają w swej ścianie

komórkowej toksycznych lipopolisacharydów oraz mają tylko pojedynczą warstwę

membrany cytoplazmatycznej co ułatwia sekrecję wytwarzanych przez nie enzymów.

T ABELA 1. N AJWAŻNIEJSZE POZAKOMÓRKOWE ENZYMY BAKTERII Z RODZAJU B ACILLUS

GATUNEK

ENZYM

Hydrolazy polisacharydów

Alkalofilne szczepy Bacillus sp.

α-amylaza, β-1,3-glukanaza, liaza pektynowa, pululanaza

Bacillus amyloliquefaciens

α-amylaza, galaktanaza, izoamylaza, mannanaza, ksylanaza

Bacillus brevis

celulaza

Bacillus circulans

chitynaza, β-1,3-glukanaza, liaza pektynowa, β-1,6-glukanaza, fosfomannanaza

Bacillus cereus

β-amylaza

Bacillus coagulans

α-amylaza, izomeraza glukozowa

Bacillus firmus

celulaza, ksylanaza

Bacillus licheniformis

α-amylaza

Bacillus macerans

α-amylaza, glukonotransferaza cyklodekstryn

Bacillus megaterium

β-amylaza, glukonotransferaza cyklodekstryn, dekstranaza

Bacillus polymyxa

β-amylaza, celulaza, β-1,3-glukanaza, izoamylaza, liaza pektynowa, ksylanaza

Bacillus pumilus

liaza pektynowa, celulaza, lichenaza

Bacillus sphaericus

liaza pektynowa

Bacillus subtilis

α-amylaza, arabinaza, celulaza, α-glukozydaza, dekstranaza, galaktanaza, , liaza

pektynowa, ksylanaza, β-1,3-glukanaza

Bacillus stearothermophilus

α-amylaza

Bacillus sp.

agaraza, chitosanaza

Hydrolazy peptydowe

Alkalofilne szczepy Bacillus sp.

proteinaza serynowa alkalofilna

Bacillus amyloliquefaciens

metaloproteinaza, subtilizyna

Bacillus cereus

metaloproteinaza

Bacillus licheniformis

subtilizyna, aminopeptydaza

Bacillus megaterium

metaloproteinaza

Bacillus polymyxa

metaloproteinaza

Bacillus pumilus

subtilizyna

Bacillus subtilis

metaloproteinaza, subtilizyna, esteraza, aminopeptydaza

Bacillus stearothermophilus

metaloproteinaza

Bacillus sp.

proteinaza halofilna

Penicylazy

Bacillus anthracis

β-laktamaza

Bacillus cereus

β-laktamaza

Bacillus licheniformis

β-laktamaza

Bacillus megaterium

β-laktamaza, acylaza penicylinowa

Bacillus sphaericus

acylaza penicylinowa

Bacillus subtilis

β-laktamaza

Nukleazy i fosfatazy

Bacillus amyloliquefaciens

alkaliczna fosfataza, deoksyrybonukleotydo-rybonukleaza

Bacillus cereus

alkaliczna fosfataza, deoksyrybonukleotydo-rybonukleaza, 5-nukleotydaza

Bacillus megaterium

5-nukleotydaza

Bacillus subtilis

alkaliczna fosfataza, deoksyrybonukleotydo-rybonukleaza, 5-nukleotydaza, 3-

nukleotydaza

Enzymy bakteriolityczne

Bacillus licheniformis

endo-N-acetyloglukozoaminidaza, amidaza-N-acetylomuramylo-L-alaninowa

Bacillus subtilis

endo-N-acetyloglukozoaminidaza, egzo-N-acetyloglukozoaminidaza, endo-N-

acetylomuramidaza, amidaza-N-acetylomuramylo-L-alaninowa

Inne enzymy

Bacillus anthracis

fosfolipaza C

Bacillus cereus

fosfolipaza C

Bacillus licheniformis

lipaza

Bacillus subtilis

lipaza

Bacillus thiaminolyticus

tiaminaza

Bacillus thuringiensis

fosfolipaza C

__________________________________________________________________________________________

K ATEDRA T ECHNOLOGII F ERMENTACJI I M IKROBIOLOGII T ECHNICZNEJ

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

M IKROBIOLOGIA T ECHNICZNA – studia zaoczne

Ćwiczenie 3

część teoretyczna

___________________________________________________________________________

Bakterie Bacillus podzielono na 3 grupy (tab. 2.). Bakterie należące do grup A i B są

tradycyjnie używane w produkcji żywności lub są uważane za nieszkodliwe – produkowane

przez nie enzymy nie wymagają testowania lub testowane są jedynie pod kątem ewentualnej

toksyczności. Należą tu 22 gatunki niepatogenne. Natomiast 26 gatunków, które mogą być

patogenne zalicza się do grupy C, stosowanie wytwarzanych przez nie enzymów w produkcji

żywności wymaga specjalistycznych testów.

T ABELA 2. P ODZIAŁ BAKTERII Z RODZINY B ACILLUS

GRUPA

OPIS

GATUNKI

Bacillus subtilis (wraz ze szczepami

znanymi jako B. mesentericus, B.

natto, B. amyloliquefaciens )

Wytwarzane enzymy nie wymagają

testowania

Wytwarzane enzymy testowane są

pod kątem ewentualnej

toksyczności

B. stearothermophilus,

B. licheniformis,

B. coagulans,

B. Megaterium,

B. circulans,

B. pumilus

Ewentualne stosowanie enzymów

produkowanych przez te gatunki w

przetwórstwie żywności wymaga

specjalistycznych testów

B. cereus,

B. anthracis

Zestaw enzymów wytwarzanych przez bakterie z rodzaju Bacillus jest bardzo szeroki

(tab. 1.) i nie do końca wykorzystany. Enzymy te znajdują zastosowanie w procesach

biotransformacji i biodegradacji. Na skalę przemysłową laseczki Bacillus wykorzystuje się

także do produkcji antybiotyków (bacytracyny, gramicydyny S) i bioinsektycydów (δ-

endotoksyn). W inżynierii genetycznej są wykorzystywane są do klonowania genów

przeznaczonych dla innych biorców. Dodatkowym atutem jest dość duża podatność szczepów

bakterii Bacillus na doskonalenie na drodze mutacji i selekcji, powodując coraz większą ich

produktywność.

Enzymy

Enzymy pozakomórkowe, zwane też egzoenzymami , to enzymy wydzielane z

komórek do otaczającego środowiska. Zalicza się tu także niektóre enzymy związane z

błonami komórkowymi, które w odpowiednich warunkach są uwalniane poza komórkę. Z

fizjologicznego punktu widzenia, służą najprawdopodobniej komórce do pozyskiwania

związków odżywczych z otoczenia. Niektóre są wydzielane podczas sporulacji. Większość

enzymów pozakomórkowych ma charakter indukcyjny . To znaczy, że w nieobecności

substratu są produkowane w komórkach w niewielkich ilościach (poziom bazowy). W chwili

pojawienia się substratu w pożywce, ta niewielka ilość enzymu wystarcza by przereagować z

substratem. W wyniku tej reakcji (najczęściej rozkładu) uwalniany jest induktor, który wnika

do komórki i uaktywnia syntezę enzymu na dużą skalę. W momencie wyczerpania substratu,

ilość enzymu wraca do poziomu bazowego.

Obok indukcji, drugim podstawowym mechanizmem regulacji metabolizmu bakterii z

rodzaju Bacillus na poziomie genetycznym, jest represja . Represja kataboliczna polega na

nieustannym hamowaniu biosyntezy enzymów w pożywkach zawierających glukozę lub

inne łatwo przyswajalne źródła węgla . Biosynteza proteinaz oraz wielu enzymów

działających na substraty zawierające azot jest silnie hamowana u bakterii Bacillus przez jony

__________________________________________________________________________________________

K ATEDRA T ECHNOLOGII F ERMENTACJI I M IKROBIOLOGII T ECHNICZNEJ

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: