Temat: Biosensory Glukozy

Jednym z problemów do rozwiązania jest znalezienie kompromisu między efektywnymi metodami immobilizacji a szybkimi i prostymi procedurami wytwarzania sensorów. Zamykanie (pułapkowanie) enzymów w matrycy polimerowej jest korzystną metodą, ponieważ jest szybka i prosta. Taka metoda immobilizacji nie wymaga tworzenia wiązań kowalencyjnych pomiędzy matrycą a cząsteczkami enzymów zachowując w ten sposób aktywność enzymów. Inne techniki immobilizacji włączają sieciowanie dwufunkcyjnymi reagentami (np. aldehyd glutarowy) i tworzeniem wiązań kowalencyjnych.

Praca opisuje nowy typ membrany do konstrukcji amperometrycznego biosensora glukozy. Membrana bazuje na fotoutwardzalnym polimerze akrylowo-poliuretanowym (acrylated-polyurethane photocurable polymer), do którego enzymy są unieruchamiane w wyniku tzw. pułapkowania. Amperometryczny przetwornik oparty jest na przewodzącym kompozycie grafitowo-epoksydowym.

Zaletami stosowania fotosieciowania polimerów do immobilizacji enzymów są:

-polimer ten umożliwia dobrą adhezję (przyczepność) membrany do powierzchni przetwornika

- proces przygotowania membrany z użyciem fotoutwardzalnego polimeru jest szybki i prosty oraz może być przystosowany do fotolitograficznych technik konstrukcji membran (np. ISFET).

Po wymieszaniu wszystkich składników membrany krótki czas naświetlania około 30 s promieniowaniem UV o długości fali 365nm pozwala uzyskać membranę z długo terminową stabilnością około 3 miesięcy.

Opracowano nowatorski biosensor glukozy oparty na odlanej warstewce lipidowej. Taki model biologicznej membrany został użyty do zapewnienia środowiska biologicznego na powierzchni elektrody, ponadto może taka warstwa silnie redukować zakłócenia i skutecznie wykluczyć hydrofilowe elektroaktywne materiały, które mogą zakłócać detekcję. Jako mediator wybrano TTF ze względu na jego dużą zdolność przenoszenia elektronu, i silne powiązanie z warstwą lipidową. Oksydaza glukozy została unieruchomiona w hygrożelu umieszczonym na warstewce lipidowej. Wpływ pH i przykładanego potencjału był poszukiwany w celu optymalnej przydatności analitycznej przy użyciu metody amperometrycznej. Czas odpowiedzi biosensora był mniejszy niż 20s, a zakres liniowy sięgał aż do stężenia 10 mmol/l z ograniczeniem detekcji 0.02mmol/l. Opracowany biosensor wykazywał także dużą stabilność i odtwarzalność.

W celu osadzenia membrany rozpuszczono 0.15g przygotowanego koktajlu w 0.3ml etanolu aby uzyskać całkowitą homogenizację (ujednorodnienie). Następnie 30ml tego roztworu osadzono na powierzchni przetwornika i poddano działaniu promieniowania UV o długości fali 365nm przez około 30s. Następnie membranę płukano etanolem. Uzyskiwana w ten sposób membrana miała grubość 100mm.

Biosensory przechowywano i suszono przed każdym użyciem w temp. 4°C.

Rys. Schemat procesu tworzenia biosensora: (a) amperometryczny przetwornik z kompozytem epoksydowo-grafitowym; (b) osadzanie membrany z roztworu i fotopolimeryzacja; (c) przemywanie membrany etanolem. (1) korpus elektrody wykonany z PCV; (2) łącznik; (3) płytka miedziana; (4) warstwa przewodząca epoksydowo-grafitowa;
(5) membrana enzymatyczna.

Korpus elektrody roboczej stanowił pręt teflonowy (o zewnętrznej średnicy 11mm) z wgłebieniem na jednym z końców (dziura o średnicy 7 mmm i głębokości 3mm), w której umieszczono wypełnienie z pasty węglowej. Kontakt elektryczny zapewniał drucik platynowy przechodzący przez środek pręta teflonowego. Pastę węglową przygotowano przez dodanie 1.58g oleju parafinowego do 5.00g spektralnego proszku węglowego. Pastę węglową zmodyfikowaną (masowo) MnO2/GOD przygotowano zastępując 3.8% proszku węglowego dwutlenkiem manganu oraz odpowiednie ilości węgla przez GOD, a następnie dodawano oleju parafinowego. Przygotowana mieszanina była homogenizowana i odstawiana na co najmniej 24 godziny. Następnie zmodyfikowaną pastę upychano do dziury w korpusie elektrody i wygładzano płytką PTFE.

Poniższy schemat przedstawia enzymatyczne, chemiczne i elektrochemiczne reakcje zachodzące w warstwie rozpoznawczej sensora.

Glukoza jest enzymatycznie utleniana tlenem cząsteczkowym tworząc glukonolakton i nadtlenek wodoru (I). Powstały nadtlenek wodoru reaguje z dwutlenkiem manganu tworząc związki/tlenki manganu na niższym stopniu utlenienia (II), które mogą być elektrochemicznie utlenione z powrotem do dwutlenku manganu (III). Płynący wówczas prąd może być bezpośrednio związany ze stężeniem glukozy. Poza tym można założyć zachodzenie szybkich procesów elektrochemicznych i kinetycznie wolniejszego reutlenienia nadtlenkiem wodoru układu MnO/Mn2O3 (IV).

Proces wytwarzania membrany jest szybki i prosty. Stosowany polimer jest bardziej stabilny niż niektóre hydrożele stosowane do immobilizacji enzymów. Poza tym, pomimo jego hydrofilowego charakteru, proces dyfuzji substratów i produktów reakcji enzymatycznych przez membranę jest bardzo dobry. Ten polimer może być stosowany do różnych przetworników takich jak kompozyty epoksydowo-grafitowe, platyna, przetworniki półprzewodnikowe itp. W przypadku przetworników półprzewodnikowych membrana może być osadzana i kształtowana technikami litograficznymi, co umożliwia zautomatyzowanie procesów.

Wprowadzenie grafitu w membranę polimerową powoduje około trzykrotne wzmocnienie sygnału analitycznego. W tym przypadku mechanizm reakcji zachodzi na granicy faz membrana-roztwór, zatem zredukowane zostały procesy dyfuzji. Po za tym czas życia takiego sensora jest krótszy niż sensora bez grafitu w membranie.

Nowy typ biosensorów amperometrycznych na bazie pasty węglowej modyfikowanej MnO2/GOD ma rokujące nadzieje osiągi analityczne i może być stosowany do analizy praktycznych próbek np. wino. Przedstawiony biosensor glukozy w porównaniu z innymi sensorami amperometrycznymi wykazuje kilka zalet. Przede wszystkim może być przygotowany w prosty sposób z użyciem tanich, chemicznie trwałych i praktycznie nieszkodliwych mediatorów.