Reakcja łańcuchowej polimeryzacji (Polymerase Chain Reaction). Dzięki reakcji PCR można powielić fragment DNA nawet w miliardach kopii. Jedna cząsteczka DNA może zostać amplifikowana do ilości, które umożliwiają przeprowadzenie jej charakteryzacji i manipulowanie nią. Technika ta wykorzystywana jest do wykrywania patogenów i chorób genetycznych, odkrywania źródła pochodzenia włosa pozostawionego na miejscu zbrodni i "wskrzeszania" genów ze skamieniałości. Załóżmy, że mamy dwuniciową cząsteczkę DNA zawierającą docelową sekwencję otoczoną przez sekwencje nas nie interesujące. Stosując metodę PCR możemy uzyskać miliony kopii sekwencji docelowej, pod warunkiem, że znamy sekwencje bezpośrednio do niej przylegające. Aby przeprowadzić reakcję PCR, do roztworu zawierającego docelową sekwencję DNA dodajemy:
· parę starterów (primerów), które hybrydyzują z sekwencjami przylegającymi do sekwencji docelowej
· trifosforany wszystkich czterech deoksyrybonukleozydów (dNTP)
· termostabilną polimerazę DNA Cykl reakcji PCR składa się z trzech etapów :1. Oddzielenie nici DNA (denaturacja). Dwie nici wyjściowej cząsteczki DNA oddzielają się przez ogrzewanie roztworu w temperaturze 95*C przez 15 sekund.2. Hybrydyzacja starterów (ang. annealing). Roztwór jest gwałtownie chłodzony do temperatury 54*C, aby umożliwić hybrydyzację starterów z nićmi DNA. Jeden starter hybrydyzuje z sekwencją przylegającą do końca 3' sekwencji docelowej, natomiast drugi również do końca 3', ale nici do niej komplementarnej. Wyjściowa cząsteczka DNA nie ulega renaturacji do formy dwuniciowej, ponieważ startery są dodawane, w stosunku do niej, w dużym molowym nadmiarze. Startery zwykle mają długość od 20 do 30 nukleotydów.3. Synteza DNA (elongacja). Roztwór ogrzewa się do 72*C, to jest do temperatury optymalnej dla polimerazy DNA Taq. Ta termostablina polimeraza pochodzi z bakterii Thermus aquaticus żyjących w gorących źródłach. Polimeraza wydłuża sekwencje od starterów w kierunku sekwencji docelowej, ponieważ synteza DNA przebiega w kierunku 5' do 3'. Synteza DNA zachodzi na obu niciach i rozciąga się poza sekwencję docelową.Te trzy etapy reakcji można powtarzać cyklicznie, zmieniając temperaturę mieszaniny reakcyjnej. Termostabliność polimerazy umożliwia przeprowadzenie reakcji w zamkniętych probówkach; po pierwszym cyklu nie dodaje się żadnych odczynników. Dupleksy są podgrzewane i rozpoczyna się drugi cykl reakcji, w wyniku którego powstają cztery cząsteczki dwuniciowe, po czym inicjowany jest trzeci cykl. Na końcu trzeciego cyklu pojawiają się dwie krótkie nici, które składają się jedynie z sekwencji docelowej i odcinków starterowych. Następne cykle prowadzą do powielenia sekwencji docelowej wykładniczo, podczas gdy dłuższe cząsteczki DNA są powielane liniowo i służą jako matryce do syntezy większej liczby krótkich fragmentów. Teoretycznie po n cyklach sekwencja jest powielona 2n razy. Po dwudziestu cyklach DNA jest powielony milion razy, a po 30 cyklach - miliard razy, i to w czasie krótszym niż jedna godzina.
· sekwencja powielanego fragmentu nie musi być znana, konieczna jest tylko znajomość sekwencji przylegających do niego
· powielana sekwencja może być znacznie dłuższa niż startery
· amplifikacja może zajść również wtedy, gdy startery nie są idealnie komplementarne do sekwencji otaczających
· metoda PCR jest wysoce specyficzna, ponieważ hybrydyzacja starterów zachodzi w wysokiej temperaturze (54*C), a przez to jest bardzo dokładna, na ścisłe dopasowanie startera i komplementarnej do niego sekwencji mają wpływ temperatura i stężenie soli, w wysokiej temperaturze, jedynym DNA, jaki ulega amplifikacji, jest odcinek zawarty pomiędzy parą starterów hybrydyzujących z matrycowym DNA
· PCR jest niezwykle czułą metodą, pozwalającą powielić i wykryć nawet pojedynczą cząsteczkę DNA
nie_za_pominajka