Elektroforeza.pdf

ELEKTROFOREZA

ELEKTROFOREZA W ŻELU AGAROZOWYM

Agaroza to frakcja agaru oczyszczona z krasnorostów, w postaci handlowej jest białym lub

lekko żółtym proszkiem. Jest to polisacharyd zbudowany z około 800 liniowo połączonych reszt

heksozy (inaczej – 400 reszt agarobioza). Agarobioza jest dwucukrem zbudowanym z D-galaktozy i

3,6-anhydro-L-galaktozy. Powstawanie żelu agarozowego jest reakcją odwracalną, w wyniku której

pojedyncze, losowo zwinięte łańcuchy układają się w dwuniciową, helikalną strukturę III-rzędową,

które rozgałęziają się tworząc sieć. Agaroza rozpuszcza się bardzo łatwo w gotującej się wodzie i

pozostaje w stanie płynnym aż do temperatury około 40 ° C. Poniżej tej temperatury zestala się w

postaci porowatego żelu. Po zestaleniu pozostaje w tej postaci nawet w podwyższonych

temperaturach sięgających kilkudziesięciu ° C. Rozmiary porowatości można regulować stosując

agarozę w różnych stężeniach. Im wyższe jest stężenie agarozy, tym bogatsze jest usieciowanie i

drobniejsze są pory. Zwykle przygotowuje się żele o stężeniach agarozy z przedziału 0,4-4,0%.

Zaletą żeli agarozowych jest łatwość i szybkość ich przygotowania oraz możliwość separacji

dużych makromolekuł np. DNA i RNA. Wadą zaś jest słaba wytrzymałość mechaniczna żeli oraz

trudność ich utrwalania po rozdziale. Wyschnięte żele rozsypują się pod wpływem bardzo

niewielkich sił.

Żel agarozowy stosuję się do rozdzielania DNA o szerokim zakresie mas cząsteczkowych.

Wadą elektroforezy w żelu agarozowym jest słaba rozdzielczość frakcji DNA różniącego się

poniżej 5% wielkości.

Elektroforeza w żelu agarozowym prowadzona jest w aparatach ustawionych poziomo, a

rozdział elektroforetyczny prowadzony jest w buforze TBE×1 (90 mM Tris-base, 90 mM kwas

borowy, 2 mM EDTA, pH 8) lub TAE×1 (40 mM Tris-base, 40 mM lodowy kwas octowy, 1 mM

EDTA, pH 8).

Cząsteczka DNA jest naładowana ujemnie w środowisku obojętnym i alkalicznym, a więc

umieszczona w polu elektrycznym, przemieszcza się w kierunku anody. DNA o tych samych

masach cząsteczkowych, ale różnych konformacjach charakteryzuje różna ruchliwość

elektroforetyczna. Im dłuższa jest cząsteczka DNA lub RNA tym dłużej odnajduje ona drogę

poprzez pory żelu. Jeżeli umieścimy DNA w żelu agarozowym i przyłożymy niskie napięcie to

prędkość migracji DNA o różnych ciężarach cząsteczkowych jest proporcjonalna do napięcia. Aby

otrzymać optymalny rozdział DNA o wielkości większej niż 2 kp.z, elektroforeza prowadzona jest

w polu elektrycznym o natężeniu nie większym niż 5V/cm. Powyżej tego napięcia fragmenty DNA

przemieszczają się z prędkością odwrotnie proporcjonalną do logarytmu ich ciężaru

cząsteczkowego. Elektroforetyczne zachowanie DNA w żelu agarozowym nie zależy od składu

zasad azotowych i słabo zależy od temperatury. Jednak jeżeli stosuje się żele agarozowe o stężeniu

mniejszym niż 0,5% należy elektroforezę prowadzić w temperaturze około 4°C.

Do uwidocznienia DNA po lub w trakcie elektroforezy stosowany jest rutynowo bromek

etydyny (EtBr), który interkaluje pomiędzy sąsiednie pary dwuniciowego DNA (powinowactwo

EtBr do jednoniciowego DNA jest znacznie słabsze) (skrypt str. 23). Należy pamiętać, że obecność

związku interaklującego do DNA w żelu agarozowym zmniejsza ruchliwość elektroforetyczną

DNA o około 15%. Innym barwnikiem DNA jest np. SYBR Green, którego czułość barwienia

dwuniciowego DNA jest około 25 razy większa niż EtBr.

ELEKTROFOREZA W ŻELU POLIAKRYLAMIDOWYM (PAGE)

Żele poliakrylamidowe - przygotowywane są z roztworu monomerów akrylamidu i

substancji sieciujących (ang. cross-linkers). Należy zawsze pamiętać, że akrylamid w postaci

monomerycznej jest bardzo silną neurotoksyną i nawet po procesie polimeryzacji stanowi poważne

zagrożenie dla zdrowia ze względu na pozostałości swobodnych monomerów w objętości żelu. Jako

substanję sieciującą stosuje się najczęściej N,N’-metylenebisakrylamid (bis-akrylamid). Reakcję

polimeryzacji, będącą w istocie wolnorodnikową reakcją polimeryzacji, można zainicjować

chemicznie lub fotochemicznie. Przy chemicznej inicjacji procesu najczęściej stosuje się

nadsiarczan amonu w obecności katalizatora N,N,N’,N’-tetrametyletylenodiaminy (TEMED).

Fotochemiczne wyzwolenie procesu polimeryzacji zachodzi w obecności ryboflawiny pod

działaniem długofalowego światła UV i jest katalizowane przez TEMED. Ze względu na

wydzielanie się znacznych ilości ciepła podczas polimeryzacji akrylamidu, dla właściwego

przebiegu procesu należy przestrzegać odpowiedniego dozowania substancji inicjujących i

katalizujących, tak aby czas polimeryzacji nie był krótszy od 30 minut. W szczególnych

przypadkach, gdy zawartość akrylamidu przekracza 15%, należy zapewnić efektywne

odprowadzanie powstałego ciepła poprzez umieszczenie kasety z polimeryzującym żelem w łaźni

wodnej. Gęstość sieciowania oraz rozmiary porów można regulować poprzez odpowiedni dobór

stężenia akrylamidu i bisakrylamidu.

Właściwości żelu przyjęto opisywać dwoma parametrami. Najczęściej mówi się o całkowitym (ang.

total) stężeniu akrylamidu:

T [%] = ((akrylamid + bis-akrylamid) [g] / objętość [ml]) x 100

Dopełniającym parametrem jest wagowy stosunek ilości substancji sieciującej do sumy akrylamidu

i substancji sieciującej:

C [%] = (bis-akrylamid [g] / (akrylamid + bis-akrylamid) [g]) x 100

Ze wzrostem wartości T maleje średni rozmiar porów. Natomiast minimalny rozmiar porów, przy

zadanej wartości T, uzyskuje się dla wartości C = 5%. Powyżej i poniżej tej wartości rozmiary

porów wzrastają.

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym jest wykorzystywana do rozdzielania głównie

białek i analizy małych fragmentów DNA.

W elektroforezie poliakrylamidowej najczęściej stosuje się technikę elektroforezy

pionowej. W technice tej nośnik elektroforetyczny wypełnia szklane rurki (elektroforeza rurkowa)

lub znajduje się pomiędzy dwoma płytkami rozdzielonymi przekładkami dystansowymi (ang.

spacer) (elektroforeza płytowa). Na poniższym rysunku pokazano schematycznie oba rodzaje

elektroforezy pionowej.

Rys 2. Schematyczne przedstawienie

rodzajów elektroforezy pionowej.

A. elektroforeza rurkowa (ang. tube elektrophoresis)

B. elektroforeza płytowa (ang. slab electrophoresis)

Jak łatwo zauważyć, górna część nośnika musi być przykryta warstwą buforu

elektrodowego (elektrolitu). Rozwiązanie takie ma naturalną tendencję do wyciekania buforów z

górnego naczynia, co wymaga uwagi laboranta podczas trwania rozdziału. Brak kontaktu elektrolitu

z żelem powoduje przerwanie obwodu elektrycznego i w związku z tym przerwanie procesu

elektroforezy. Inną niedogodnością tego rozwiązania jest trudność z odprowadzeniem ciepła

generowanego przez przepływający prąd. Dotyczy to szczególnie elektroforezy rurkowej. W

przypadku elektroforezy płytowej możliwe jest odprowadzanie ciepła przez ściankę kontaktującą

się z jedną z płyt. Zaletą tego typu rozwiązania jest zwykle stosunkowo niska cena dostępnych na

rynku aparatów.

Metody elektroforetyczne stosowane w praktyce są pochodnymi lub kombinacją trzech

podstawowych rodzajów separacji. Są to: elektroforeza strefowa (ang. zone electrophoresis),

izotachoforeza (ang. isotachphoresis) oraz ogniskowanie izoelektryczne (ang. isoelectric focusing).

Elektroforeza strefowa - podstawowy i najszerzej stosowany rodzaj elektroforezy. Odbywa się w

nośniku, w którym elektrolit ma w całej objętości stałą wartość pH. Różnica dystansów migracji

poszczególnych makrojonów, w ciągu określonego czasu, w bezpośredni sposób wynika z różnicy

w ruchliwości elektroforetycznej tych jonów w nośniku w obecności pola elektrycznego.

Izotachoforeza - w tym rodzaju elektroforezy rozdział odbywa się w nośniku, w którym występuje

nieciągłość wartości pH. Makrojony separowanej próbki migrują w obszarze pomiędzy dwoma

systemami elektrolitów o różnej wartości pH i różnej ruchliwości jonów elektrolitu. Elektrolit

wiodący (ang. leading electrolyte) zawiera jony o dużej ruchliwości elektroforetycznej, znacznie

przewyższającej ruchliwość makrojonów. Z kolei elektrolit zamykający (ang. tailing electrolyte)

zawiera jony o bardzo niskiej ruchliwości elektroforetycznej, zwykle znacznie niższej od

ruchliwości makrojonów. W obszarze pomiędzy tymi dwoma elektrolitami znajdują się separowane

makrojony. Wszystkie jony - wiodące, zamykające oraz makrojony - migrują w tym obszarze z tą

samą prędkością ale w ściśle określonym porządku. Najpierw przemieszczają się jony wiodące, a za

nimi najszybsze makrojony. Potem kolejno makrojony zgodnie z ich malejącą ruchliwością i w

końcu jony zamykające. Wynikiem tego rodzaju elektroforezy jest uporządkowanie makrojonów

zgodnie z ich malejącą ruchliwością elektroforetyczną, przy czym separacja ta zachodzi w bardzo

małym obszarze będącym granicą dwóch systemów elektrolitów. Uzyskuje się w ten sposób

dodatkowy efekt zagęszczania makrojonów w małej objętości.

Elektroforeza poliakrylamidowa DNA.

Najlepszy rozdział uzyskuje się dla DNA o długości mniejszej niż 1000 par zasad. W żelach

tych można efektywnie rozdzielać także jednoniciowe fragmenty DNA i RNA. Elektroforezę w

żelach poliakrylamidowych prowadzona jest w aparaturze ustawionej pionowo, a więc migracja

cząsteczek DNA jest zgodna z kierunkiem siły ciążenia, gdzie jednoniciowe DNA charakteryzują

się spowolnioną, w stosunku do dwuniciowego DNA, migracja w żelu. Rozdział elektroforetyczny

prowadzony jest w buforze TBE×1. Jest to odmiana elektroforezy strefowej natywnej. DNA w żelu

poliakrylamidowym można wybarwiać za pomocą np. EtBr lub Sybr Gold.

Żele poliakrylamidowe mają przewagę nad żelami agarozowymi z kilku przyczyn:

● zdolność rozdzielcza żeli poliakrylamidowych jest tak duża, że można rozdzielać cząsteczki

DNA różniące się o 1 p.z.

● studzienkę żelu poliakrylamidowego można załadować znacznie większą ilością DNA niż w

żelu agarozowym

● DNA odzyskany z żelu poliakrylamidowego jest czysty (nie wymaga dodatkowego

czyszczenia przy stosowaniu w biologii molekularnej)

Elektroforeza poliakrylamidowa białek.

Elektroforeza natywna , to rodzaj elektroforezy strefowej prowadzony zwykle w

poliakrylamidzie w warunkach, w których makrocząsteczki pozostają niezdenaturowane. Zaletą

tego typu separacji elektroforetycznej jest możliwość odzyskania cząsteczek białkowych w stanie

pełnej aktywności biologicznej. Wadą zaś jest stosunkowo słaba rozdzielczość metody.

Rys. 3 Przykład elektroforezy białek w warunkach natywnych.

Analizie poddano białka wyekstrahowane z różnych odmian

jęczmienia. Separację przeprowadzono w żelu 25S uwodnionym

w buforze do natywnej elektroforezy pH 5,0, zawierającym mocznik

i niejonowy detergent.

Elektroforeza w obecności SDS (strefowa) - ten rodzaj elektroforezy jest najczęściej

stosowany dla separacji makromolekuł białkowych. Zastosowanie SDS (siarczan dodecylu sodu) -

substancji powierzchniowo czynnej - przyczynia się do znacznego poprawienia rozdzielczości

techniki elektroforetycznej. Potraktowanie cząsteczki białka przez SDS skutkuje powstaniem

kompleksów białko-SDS o ustalonym stosunku ładunku elektrycznego do masy. Wykazano, że 1g

białka wiąże 1,4g SDS. W kompleksie takim SDS skutecznie maskuje oryginalny ładunek białka

normalnie występujący w danym elektrolicie. Właściwość ta pozwala na łatwe i dokładne

oznaczenie mas cząsteczkowych rozdzielonych białek. Obecność SDS przynosi

szereg korzyści:

● zdecydowana większość białek jest rozpuszczalna w elektrolitach zawierających SDS,

szczególnie po redukcji mostków disiarczkowych

● separacja białek odbywa się zgodnie z ich masami cząsteczkowymi

● barwienia kompleksów białko-SDS jest znacznie wydajniejsze niż samego białka

● obecność SDS skutecznie eliminuje enzymatyczną degradację białek w trakcie separacji.

Elektroforeza nieciągła - połączenie izotachoforezy z elektroforezą strefową prowadzi do jeszcze

lepszych rezultatów separacji białek. Nośnik elektroforetyczny składa się z dwóch kontaktujących

się ze sobą części wypełnionych elektrolitami o różnym składzie i różnej wartości pH (rys. 4) (ang.

discontinue electrophoresis or disc-electrophoresis). W górnej części nośnika znajduje się żel

zagęszczający, czasami określany jako ogniskujący, (ang. stacking gel), w którym realizuje się

izotachoforeza. Uporządkowane i zagęszczone tam cząsteczki białka wchodzą do drugiej części

nośnika zwanej żelem separującym (ang. running gel). W tym żelu zachodzi elektroforeza strefowa.

Rys 4. Schemat żelu do elektroforezy

nieciągłąej.Skład elektrolitów i wartość pH obu

żeli oraz ich porowatości różnią się.

W wyniku połączenia obu metod uzyskuje się bardzo ostre prążki zawierające białka o tej samej

ruchliwości elektroforetycznej, co często jest interpretowane jako białka o tej samej masie

cząsteczkowej (rys 5).

Rys 5. Przykład elektroforezy w obecności SDS. Analizie

poddano białka zwierzęce i ryb ekstrahowane z różnych

tkanek. Rozdział wykonano w żelu ExcelGel Homogenous 1.

Dwie skrajne ścieżki zawierają standardy mas

cząsteczkowych, co pozwala przyporządkować białkom na

pozostałych ścieżkach odpowiednie masy cząsteczkowe.

BARWIENIE I DOKUMENTACJA.

Ukończenie rozdziału elektroforetycznego nie kończy procedury separacji. Większość

białek i kwasów nukleinowych nie jest widoczna w świetle białym. Niezbędne jest ich wybarwienie

(wizualizacja) w żelach lub na membranach, tak aby uzyskać informację o dystansie ich migracji i

ich ilości w prążku

Barwienie - stosowanych jest wiele metod wizualizacji żeli i membran. Białka najczęściej

wybarwia się stosując naturalne barwniki, takie jak błękit kumassi (ang. Coomassie Brilant Blue)

czy czerń amidową. Barwnik dodawany jest zwykle do roztworu utrwalającego położenie białka w

żelu (denaturacja i unieruchomienie molekuł), po czym nadmiar barwnika jest wymywany.

Pozostaje tylko barwnik związany z białkami. Czułość takiej detekcji białek jest stosunkowo dobra.

Można w ten sposób znaleźć 1 μg białka w prążku. Znacznie bardziej czułą metodą jest barwienie

srebrem. Metoda ta pozwala oznaczyć 10 ng białka w prążku. Przy pomocy srebra można również

wybarwić kwasy nukleinowe oraz oligonukleotydy, a czułość detekcji zbliżona jest również do 10

ng DNA na prążek.

Barwienie fluoroforami - tradycyjnie oligonukleotydy barwione są przy pomocy bromku etydyny,

barwnika wykazującego właściwości fluorescencyjne. Obraz separacji makrocząsteczek może być

wtedy uwidoczniony w świetle UV (około 300 nm). Ten sposób barwienia wymaga dużej

ostrożności ze strony laboranta ze względu na silnie karcinogenne właściwości bromku etydyny.

Obecnie dostępne są liczne barwniki fluorescencyjne pozwalające na uwidocznienie białek i

oligonukleotydów po zakończeniu elektroforezy lub wybarwienie makrocząsteczek przed separacją.

Wszystkie te znaczniki uwidaczniają położenie prążków w świetle UV lub rzadziej w świetle

widzialnym. Czułość detekcji jest porównywalna z barwieniem srebrem lub jest nieco lepsza.

Dokumentacja rozdziałów - najprostszą formą dokumentacji rozdziałów

elektroforetycznych wykonanych w żelach poliakrylamidowych jest ich wysuszenie pomiędzy

warstwą bibuły i celofanu lub pomiędzy dwoma warstwami celofanu. Wysuszony w ten sposób żel

można przechowywać dowolnie długo bez widocznego uszczerbku w jakości tego dokumentu. Żele

poliakrylamidowe przygotowane na folii można suszyć bez okrywania celofanem. Trudności

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: