BIOKATALITYCZNA INWERSJA SACHAROZY W PRZEPŁYWOWYCH.pdf

ĆWICZENIE 29.

BIOKATALIZATORY I ICH ZASTOSOWANIE W PRZEMYŚLE

ĆWICZENIE 30.

BIOKATALITYCZNA INWERSJA SACHAROZY W PRZEPŁYWOWYCH

REAKTORACH KOLUMNOWYCH

OSOBY PROWADZĄCE:

mgr inż. Katarzyna Jodko (pok.134, konsultacje: środy 10 30 -11 30 , czwartki 13 00 -14 00 )

dr hab. Grzegorz Litwinienko (pok. 132, konsultacje: środy 10 30 -11 30 , czwartki 13 00 -14 00 )

LITERATURA:

1. Atkins, P. W. Równowaga chemiczna. W: Chemia fizyczna . PWN 2007, 201-227.

2. Atkins, P. W. Szybkość reakcji chemicznych. W: Chemia fizyczna . PWN 2007, 735-763.

3. Berg, J. M., Tymoczko, J. L. i L. Stryer. Enzymy. Podstawowe pojęcia i kinetyka.

W: Biochemia. PWN 2007, 189-228.

4. Ishikawa, T., Karnkowska, A., Lilpop, J. i J. Urbański. Słodki świat enzymów. Szkoła

Festiwalu Nauki (materiały dostępne na stronie: www.sfn.edu.pl).

5. Walory, J., Pilarek, M., Kalinowska, M. i H. Jaworowska-Deptuch. Kinetyka reakcji

enzymatycznej. W: Biochemia. Ćwiczenia laboratoryjne. Oficyna Wydawnicza PW 2003,

44-60.

6. Adamczak, M. Biokataliza i jej zastosowanie. W: Podstawy biotechnologii przemysłowej .

Red. W. Bednarski i J. Fiedurek. WNT 2007, 317-378 .

7. Murray R. K., Granner D. K., Mayes P. A., i V. Rodwell. rozdz. I.8-I.11 w: Biochemia

Harpera, Wydawnictwo Lekarskie PZWL Warszawa 1995, str. 82-118

8. Malepszy, S. Zabiegi technologiczne zwiększające produkcję metabolitów wtórnych.

W: Biotechnologia roślin . PWN 2001, 331-334.

Wymagania do ćwiczeń:

1. Definicje: szybkość / rzędowość / cząsteczkowość / stała równowagi reakcji chemicznej,

równanie Arrheniusa, reguła van’t Hoffa, energia aktywacji, kataliza homogeniczna

i heterogeniczna (przykłady), opis oddziaływań katalizatora z substratem, biokataliza,

biokatalizator, enzym, rybozym, kofaktor, enzymy allosteryczne, teoria kompleksu

aktywnego.

2. Właściwości enzymów / biokatalizatorów: aktywność, wydajność syntezy produktu, liczba

obrotów enzymu, selektywność substratowa i typu reakcji.

3. Mechanizm działania enzymów: modele opisujące działanie enzymów, klasyfikacja

enzymów.

4. Kinetyka Michaelisa-Menten – założenia i wyprowadzenie równania, sens fizyczny stałych

obecnych w równaniu, możliwe uproszczenia, sposób wyznaczania parametrów

charakteryzujących enzym.

5. Regulacja reakcji enzymatycznych: inhibicja kompetytywna i niekompetytywna, wpływ

parametrów intensywnych na szybkość reakcji enzymatycznej.

6. Techniki instrumentalnej analizy ilościowej (spektroskopia UV-Vis, prawo Lamberta-

Beera, sporządzanie krzywej wzorcowej, przeliczanie stężeń).

7. Dodatkowo studenci są proszeni o wybranie dowolnego enzymu i samodzielne (pisemne!)

opracowanie jego charakterystyki w oparciu o dostępne bazy literaturowe. Opracowanie to

powinno obejmować – numer wg klasyfikacji E.C., typ katalizowanej reakcji, znaczenie

katalizowanego procesu w organizmie, struktura centrum aktywnego (wraz z kofaktorem,

jeżeli występuje), ewentualne inhibitory i mechanizm ich działania. Postuluje się, żeby

studenci z jednej grupy wybierali różne enzymy do scharakteryzowania.

Poniższy wstęp zakłada znajomość podstawowych definicji i pojęć kinetyki chemicznej,

z którymi student zapoznał się podczas kursu chemii fizycznej. Ponadto, studenci są proszeni

o zapoznanie się z materiałem dotyczącym enzymów prezentowanym na wykładzie Elementy

Biotechnologii (Wykłady nr 3-5).

I. BIOKATALIZA

Procesy biochemiczne, przebiegające w organizmach żywych, są kontrolowane przez

biokatalizatory – naturalnie występujące cząsteczki przyspieszające bądź hamujące przebieg

reakcji, do których zaliczamy enzymy, hormony i witaminy (często pełniące funkcję

koenzymów). W analogii do procesów przebiegających in vivo , podejmowane są próby

przemysłowego wykorzystania materiału biologicznego do wydajnego prowadzenia reakcji

chemicznych. Zabieg taki określa się mianem biokatalizy , a zachodzącą pod wpływem

materiału biologicznego reakcję – biotransformacją lub biokonwersją .

Rolę biokatalizatora w procesach przemysłowych mogą pełnić całe komórki (w formie

zawiesiny lub immobilizowane), ekstrakt komórkowy lub enzymy o różnym stopniu

oczyszczenia, wolne lub immobilizowane. Zastosowanie hormonów (zaliczanych do

naturalnych biokatalizatorów) do przemysłowego prowadzenia reakcji chemicznych nie jest

możliwe, gdyż regulują one procesy zachodzące w komórce tylko za pośrednictwem

specyficznych receptorów, obecnych we wnętrzu komórek lub umieszczonych śródbłonowo.

Biokatalizatory stosowane są w przemyśle na coraz większa skalę - obecnie już około

130 procesów z użyciem enzymów lub komórek mikroorganizmów zostało opracowanych dla

skali produkcji przewyższającej 100 kg. Enzymy znajdują zastosowanie głównie w przemyśle

spożywczym (przemysł piekarniczy, browarnictwo, gorzelnictwo, mleczarstwo, przemysł

mięsny), przy produkcji detergentów (biodetergentów), w przemyśle papierniczym oraz

w medycynie (w tym w diagnostyce genetycznej).

II. ENZYMY

Enzymy to związki wielkocząsteczkowe wykazujące właściwości katalityczne,

umożliwiające prawidłowe tempo przemian metabolicznych w organizmach żywych

i wirusach. Wykazano wpływ enzymów na przebieg wszystkich szlaków anabolicznych

ikatabolicznych w komórce. Przykładowo, fundamentalna w procesach oddychania

komórkowego i oddychania płucnego reakcja:

CO 2 + H 2 O ' H 2 CO 3

(1)

przebiega 10 7 – razy szybciej w obecności enzymu anhydrazy węglanowej. Działanie enzymu

umożliwia więc wydajne usunięcie dwutlenku węgla, który powstaje w procesach

metabolicznych poprzez rozpuszczenie go we krwi, a następnie uwolnienie go z krwi do

wnętrza pęcherzyków płucnych. Śmiało możemy więc powiedzieć, że aktywność katalityczna

anhydrazy węglanowej warunkuje efektywną wymianę gazową.

II.1. Budowa enzymów

II.1.1. Rybozymy jako pozostałość „świata RNA”

Niemal wszystkie enzymy są białkami. Jednak w „świecie RNA” (hipotetycznym,

wczesnym etapie rozwoju życia na Ziemi) rolę katalizatorów prawdopodobnie pełniły

cząsteczki kwasu rybonukleinowego (RNA). W latach 80., Thomas Cech i Sidney Altman

niezależnie odkryli cząsteczki RNA wykazujące aktywność katalityczną - rybozymy (za co

w 1989 roku otrzymali Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii). Cech udowodnił, że proces

splicingu RNA ujednokomórkowego orzęska Tetrahymena thermophila polega na

autokatalitycznym wycinaniu intronów. Katalityczne właściwości RNA wynikają ze

zdolności przyjmowania przez te cząsteczki skomplikowanych struktur, umożliwiających

idealne przestrzenne dopasowanie do siebie enzymu i substratu katalizowanej reakcji.

Obecnie wiemy, że rybozymy występują w komórkach wszystkich organizmów i uczestniczą

przede wszystkim w mechanizmach syntezy białek (na przykład rRNA, wchodzący w skład

rybosomów, katalizuje reakcję tworzenia wiązań peptydowych miedzy aminokwasami).

Odkrycie cząsteczek RNA o właściwościach katalitycznych potwierdza przedstawioną wyżej

hipotezę „świata RNA”. Należy w tym miejscu podkreślić, że w „świecie RNA” kwas

rybonukleinowy obok funkcji katalitycznej, pełnił też rolę nośnika informacji genetycznej,

czego pozostałością we współczesnym świecie są retrowirusy (w tym wirus HIV). Postuluje

się, że cząsteczkę, która jest jednocześnie nośnikiem informacji i katalizuje swoje własne

przemiany, można uznać za pierwszą, niekomórkową formę życia na Ziemi.

II.1.2. Enzymy białkowe

Jak już wspomniano, podstawową rolą enzymów w organizmie jest katalizowanie

przebiegu ściśle określonych reakcji metabolicznych. Wobec tego, najbardziej istotnymi

właściwościami enzymów, warunkującymi prawidłowe pełnienie przez te cząsteczki swojej

funkcji, będą siła katalityczna (aktywność) i selektywność (specyficzność) . Porównywanie

aktywności różnych enzymów stało się możliwe po wprowadzeniu przez Międzynarodową

Unię Biochemiczną międzynarodowej jednostki standardowej U . Jest to ilość enzymu,

która katalizuje przemianę 1µmola substratu w czasie 1 minuty w temperaturze 30ºC,

w odpowiednim dla danego enzymu pH i przy optymalnym stężeniu substratu. Wyrażana jest

w µmol/min. Inne jednostki aktywności, które wciąż używane są w analizach biochemicznych

to: aktywność właściwa, aktywność molekularna (inaczej liczba obrotów enzymu) i katal.

Selektywność enzymu dotyczy zarówno katalizowanej reakcji (selektywność typu reakcji)

jak i substratów biorących w niej udział (selektywność substratowa). Selektywność

substratowa enzymu polega na wybraniu spośród wielu podobnych substancji tylko tej

właściwej, która będzie podlegała procesowi enzymatycznemu. Ten typ selektywności jest

efektem precyzyjnego dopasowania trójwymiarowej struktury enzymu do cząsteczki

substratu. Łańcuch polipeptydowy zbudowany z dwudziestu różnych aminokwasów zapewnia

większą selektywność niż cząsteczka kwasu nukleinowego, która jest kombinacją tylko

czterech typów nukleotydów. Z powodu większej różnorodności białek, to właśnie te

biocząsteczki stanowią główny materiał z którego zbudowana jest większość znanych

enzymów. Selektywność typu reakcji oznacza, że spośród wielu możliwych reakcji, jakim

ulegać może substrat, enzym katalizuje tylko jeden, ściśle określony proces. Efektem

selektywności enzymu jest właściwie brak zachodzenia reakcji ubocznych.

Wiele enzymów jest aktywnych (albo wykazuje podwyższoną aktywność) tylko

w obecności niebiałkowych cząsteczek – kofaktorów . W przypadku tych enzymów, ich

białkową część określamy mianem apoenzymu, a tworzony aktywny kompleks (apoenzym +

kofaktor) – holoenzymem. W roli kofaktorów mogą występować cząsteczki nieorganiczne,

jony metali, lub małocząsteczkowe związki organiczne. W oparciu o chemiczny charakter

kofaktora i moc wiązania, które tworzy z białkową częścią enzymu, w niektórych

opracowaniach kofaktory podzielono na dwie grupy:

- koenzymy , małe cząsteczki organiczne, które w sposób specyficzny łączą się

z apoenzymem; często są wiązane tylko na czas reakcji i uwalniane wraz z jej

produktami.

- grupy prostetyczne są silnie (często kowalencyjnie) związane z apoenzymem; w tej roli

mogą występować jony metali, małe cząsteczki nieorganiczne bądź organiczne.

Reakcja katalityczna zachodzi w miejscu aktywnym enzymu, czyli w obszarze

wiązania substratu i ewentualnych kofaktorów. W enzymach białkowych miejsce aktywne

składa się z reszt aminokwasowych, zwanych grupami katalitycznymi enzymu, które biorą

bezpośredni udział w zachodzącej reakcji. Miejsce aktywne enzymu jest często opisywane

jako „szczelina” w strukturze enzymu, w którą wpasowują się substraty biorące udział

w reakcji. Pełni ono dwojaką funkcję: selekcjonuje cząsteczki, które mogą brać udział w

reakcji, a ponadto umożliwia właściwe ułożenie reagenta / reagentów względem siebie.

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: