KOMPUTEROWE MODELOWANIE PEPTYDÓW I BIAŁEK.
ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA
1. Aminokwasy (budowa, grupy funkcyjne).
2. Wiązanie peptydowe, podstawowe struktury drugorzędowe łańcuchów polipeptydowych, wiązania stabilizujące struktury trzecio- i czwartorzędowe.
3. Modyfikacje potranslacyjne.
4. Centrum aktywne enzymów, koenzymy.
WPROWADZENIE
Rysunek 1 przedstawia model kanału wodnego białka AQP1 zbudowanego z czterech homomonomerów. Po lewej stronie widoczna jest struktura łańcuchów polipeptydowych. W środku - białko wraz z cząsteczkami wody przepływającymi przez cztery kanały wodne. Z prawej – układ cząsteczek wody w czasie przepływu przez błonę komórkową. AQP1jest białkiem błony erytrocytów; inne komórki posiadają analogiczne kanały wodne.
W 2001 roku jednocześnie w dwóch prestiżowych czasopismach naukowych, Science i Nature, dwie współzawodniczące grupy badaczy (jedna skupiona w Celera Genomics, druga w Human Genome Project) opublikowały pierwsze wyniki analizy sekwencji nukleotydów ludzkiego genomu.
Obecnie szacuje się, że liczba wszystkich genów człowieka nie przekracza 60 000, z czego 30 000 – 40 000 to geny kodujące białka. Do tej pory rozpoznanych zostało około 12 000 genów, wśród nich ok. 6 000 o znanej lub przewidywanej funkcji. Alternatywny splicing i modyfikacje potranskrypcyjne sprawiają, że w komórkach człowieka występuje najprawdopodobniej 85 000 różnych mRNA. W procesie pierwotnej obróbki potranslacyjnej wytwarzanych jest około 100 000 polipeptydów, które w wyniku dalszych modyfikacji mogą zostać przekształcone w ponad 500 000 różnych białek. Możliwości modyfikacji potranslacyjnych są tak duże, że kilkadziesiąt tysięcy ludzkich genów może kodować od 50 000 000 do 100 000 000 różnych funkcjonalnie cząsteczek białek.
Ze względu na olbrzymią liczbę możliwych konformacji łańcuchów polipeptydowych w białkach, określenie ich trzecio- i czwartorzędowej struktury jest bardzo trudne. W przypadku krótkich peptydów, zawierających kilkanaście aminokwasów, za pomocą odpowiednich algorytmów komputerowych można przewidzieć ich konformację. Większe cząsteczki wymagają już analizy empirycznej. Najczęściej stosowaną metodą jest badanie dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego w kryształach białek (ang. X-ray crystallography); w ten sposób poznano ponad 80% znanych struktur. Drugą metodą jest magnetyczny rezonans jądrowy (NMR); około 16% rozpoznanych struktur. W dużym uproszczeniu, dzięki umieszczeniu badanej próbki w silnym polu magnetycznym, NMR obrazuje zmiany odległości pomiędzy sąsiadującymi atomami spowodowane oddziaływaniami fizyko-chemicznymi.
Ponieważ poznano już dość dużo konformacji różnych białek, możliwe stało się przewidywanie struktury na podstawie porównania podobieństwa sekwencji aminokwasów badanego polipeptydu z białkami o określonej empirycznie konformacji (jak dotąd tylko 2% znanych struktur opracowano tą metodą).
Prolina jest jedynym aminokwasem, którego azot wchodzący w skład wiązania peptydowego znajduje się w pierścieniu. Ta specyficzna budowa proliny powoduje, że łańcuch peptydowy załamuje się pod kątem 30 stopni i zostaje zaburzona zdolność do tworzenia wiązań wodorowych pomiędzy wiązaniami peptydowymi. Prolina jest często spotykana w białkach zawierających struktury β. Również specyficzna konformacja kolagenu jest zdeterminowana między innymi przez dużą zawartość proliny i glicyny, które stanowią 50% wszystkich aminokwasów tego białka.
W wielu białkach prolina znajduje się na powierzchni cząsteczki i wchodzi w skład strukturalnych domen odpowiedzialnych za interakcje pomiędzy białkami. W ostatnim czasie zidentyfikowano wiele białek, w których znajdują się fragmenty bogate w reszty prolilowe mające ważne znaczenie funkcjonalne. Fragmenty takie rozpoznawane są przez odpowiednie domeny (SH3 i WW) innych białek. Takie interakcje pomiędzy białkami należą do istotnych mechanizmów regulacyjnych metabolizmu komórek i całego organizmu.
Dystroglikan jest silnie glikozylowanym białkiem błony komórkowej i pełni rolę receptora dla różnych białek struktur pozakomórkowych łącząc je, poprzez dystrofinę, z łańcuchami aktyny szkieletu komórkowego. Właściwe funkcjonowanie tego połączenia jest warunkiem prawidłowego rozwoju i działania mięśni. W sekwencji reszt aminokwasowych β-dystroglikanu znajduje się motyw sekwencyjny zawierający trzy reszty prolilowe (–Ser-Pro-Pro-Pro-Tyr-), który łączy się z domenami WW znajdującymi się w dystrofinie. Domeny WW mają 35-45 reszt aminokwasowych i charakterystyczną budowę:
a) reszty tryptofanylowe przedzielone są 20-22 aminokwasami,
b) pomiędzy tryptofanami znajdują się dwa lub trzy aminokwasy aromatyczne,
c) w odległości trzech reszt za drugim tryptofanem w kierunku końca karboksylowego białka znajduje się prolina.
Wszelkie mutacje powodujące zmianę aminokwasów zarówno w bogatym w prolinę fragmencie dystroglikanu bądź w domenie WW dystrofiny powodują błędy w usieciowaniu szkieletu komórkowego. Mutacje te są przyczyną różnego rodzaju dystrofii mięśniowych, w tym spotykanej stosunkowo często dystrofii typu Duchenne (DMD). Przebieg tej choroby jest gwałtowny i ciężki. Pierwsze objawy występują przed trzecim rokiem życia. Uszkodzenie mięśnia sercowego diagnozuje się około 6 roku życia. W wieku 12 lat dziecko całkowicie przestaje chodzić, a około 15 roku życia występuje już poważna dysfunkcja mięśni gładkich. Pacjent umiera zazwyczaj przed 20 rokiem życia (mediana 17 lat). Choroba wywołana jest przez mutacje w genie dystrofiny znajdującym się na chromosomie X. W związku z taką lokalizacją choroba dotyka tylko chłopców, chociaż niekiedy u kobiet nosicielek mutacji mogą wystąpić znacznie łagodniejsze objawy dystrofii mięśniowej. Mutacje są stosunkowo częste; w zależności od populacji od 5 do 10% kobiet jest nosicielkami. Choroba dotyka jednego na 4 000 chłopców. Łagodniejszy przebieg ma dystrofia mięśniowa typu Beckera. W tej chorobie również obserwuje się mutacje genu dystrofiny, ale nie zaburzają one całkowicie funkcji białka.
Na rysunku 4 przedstawiono schemat wiązania β-dystroglikanu z dystrofiną. Uwagę zwraca podobieństwo konformacji fragmentu łańcucha dystroglikanu do konformacji kolagenu (Rys. 2).
Kolejnym przykładem współdziałania białek zawierających domeny WW i prolinowe jest udział Pin1 i Cdc25C (Rys. 3) w regulacji cyklu komórkowego. Białko Cdc25C jest cyklinozależną kinazą tyrozynową indukującą mitozę, a dokładniej przejście z fazy G2 do fazy M cyklu komórkowego. W strukturze białka Cdc25C znajduje się sekwencja -Ser-Pro-, w której reszta serylowa może być ufosforylowana. Taka fosforylacja aktywuje kinazę Cdc25C i uruchamia mitozę. Z kolei ufosforylowana seryna (-fosfoSer-Pro-) jest rozpoznawana przez domenę WW białka Pin1. Drugą domeną funkcyjną Pin1 jest izomeraza peptydylo-prolilowa, która zmienia wiązanie peptydowe tworzone przez resztę prolilową z pozycji cis do trans. W konformacji trans fosfoseryna jest defosforylowana przez fosfatazę PP2A, co inaktywuje aktywność kinazy białka Cdc25C.
Inną funkcją białka Pin1 jest izomeryzacja i w konsekwencji defosforylacja białka tau. W chorobie Alzheimera obserwuje się nagromadzenie w neuronach ufosforylowanej formy tau i przypuszczalnie niższa aktywność Pin1 może być molekularną przyczyną tej choroby.
Zespół Liddle’a jest chorobą, której najważniejszym objawem jest nadciśnienie tętnicze. Przyczyną choroby jest zwiększona ilość kanałów sodowych (ENaC, Epithelial Sodium Chanel) w błonach komórek nabłonkowych. ENaC zbudowany jest z co najmniej trzech podjednostek: α, β i γ. Mutacje genów kodujących podjednostki beta lub gamma są odpowiedzialne za nadciśnienie tętnicze w zespole Liddle’a. Nadciśnienie to związane jest z hipokalemią, niską aktywnością reninową osocza i niskim poziomem aldosteronu w osoczu. Mutacje w podjednostce beta powodują wymianę lub delecję grupy aminokwasów (-Pro-Pro-Pro-Asn-Tyr-); podobna grupa aminokwasów ulega mutacji w podjednostce γ. Zanika wtedy specyficzna struktura łańcucha związana z obecnością kilku reszt prolilowych. Utrata lub zmiany w budowie bogatego w prolinę fragmentu uniemożliwiają ubikwitynację ENaC przez ligazy ubikwitynowe. Ligazy ubikwitynowe rozpoznają substraty poprzez swoje domeny WW, a następnie przenoszą z cząsteczki ubikwityny na rozpoznane białko krótki fragment polipeptydowy. Fragment ten jest sygnałem dla inaktywacji i degradacji zaznaczonego białka. Ligaza ubikwitynowa rozpoznająca łańcuch β ENaC to NEDD4. W efekcie mutacji błędy w budowie ENaC powodują zablokowanie internalizacji i inaktywacji kanału. W konsekwencji w błonie komórkowej znajduje się nadmierna liczba kanałów ENaC, co powoduje wzrost absorpcji jonów sodu w kanaliku dystalnym nerki i utratę jonów potasu, co powoduje nadciśnienie.
Zaburzenia interakcji białek zawierających motywy prolinowe z białkami partnerskimi posiadającymi domeny WW są też molekularną przyczyną choroby Huntingtona i odgrywają istotną rolę w kancerogenezie i progresji nowotworów.
CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA
UWAGA
W trakcie zajęć każda z grup studenckich wykonuje zadanie na zaliczenie, które polega na identyfikacji reszt aminokwasowych istotnych dla funkcji analizowanych białek.
Ćwiczenia polegają na analizie wybranych białek, odnalezieniu w nich grup funkcyjnych i identyfikacji reszt aminokwasowych istotnych dla funkcji i konformacji białka. Do analizy wykorzystuje się dane położenia poszczególnych atomów w białkach, uzyskane przy pomocy badań krystalograficznych (rentgenografii lub NMR). Dane takie można pobrać z udostępnionej w internecie bazy danych białek zdeponowanej w RCSB Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/index.html). Do analizy wykorzystuje się program DeepView/Swiss-Pdb Viewer (http://www.expasy.org/spdbv/).
Panel kontrolny DeepView zbudowany jest z kilku okien. Najważniejsze z nich to:
1. Okno paska zadań Toolbar służące do otwierania i zapisywania plików, pomiaru długości wiązań i kątów pomiędzy nimi, wprowadzania mutacji itp.
2. Okno Control Panel które ułatwia podświetlanie, ukrywanie, obróbkę pojedynczych reszt aminokwasowych i ich łańcuchów bocznych.
3. Okno sekwencji Alignment umożliwiające liniowe porównanie dopasowania sekwencji aminokwasów różnych polipeptydów.
4. Okno (Layers Infos) umożliwiające przełączanie pomiędzy poszczególnymi białkami/peptydami otwartymi w projekcie.
W programie używane są następujące kolory atomów:
C --> biały O --> czerwony N --> niebieski
S --> żółty P --> pomarańczowy H --> błękitny
inne --> szary
1. Modelowanie cząsteczki dystrofiny i zapoznanie się z podstawowymi funkcjami programu DeepView
Najpierw należy otworzyć program SVPDB/DeepView z ikony znajdującej się na pulpicie .
1. Z rozwijanego menu wybrać File -> Open PDB File... W otwartym oknie odszukać folder plików PDB ćwiczenia, otworzyć go i wybrać do otwarcia plik dystrofina.pdb. W pliku tym zapisane są dane koordynacyjne rozmieszczenia atomów w cząsteczce dystrofiny związanej z krótkim fragmentem dystroglikanu. Model białka otwiera się w oknie graficznym. Jest to tzw. model „druciany”, w którym poszczególne atomy przedstawione są łącznie z wiązaniami jako kolorowe krótkie odcinki. W celu poprawienia wyglądu z rozwijanego menu wybrać Display -> Use OpenGL Rendering i następnie Display -> Render in solid 3D.
2. Na pasku zadań można skorzystać z następujących narzędzi:
po kliknięciu na to narzędzie modelowana cząsteczka umieszczana jest w centrum okna. tym narzędziem można przesuwać cząsteczkę w jednej płaszczyźnie. Kolejne służy do zmiany wielkości cząsteczki. to narzędzie służy do obracania cząsteczki (jeśli jednocześnie przytrzyma się klawisz F5 cząsteczka będzie przesuwana wzdłuż osi X, klawisz F6 umożliwia przesunięcie wzdłuż osi Y, a klawisz F7 wzdłuż osi Z).
Zestaw narzędzi służy do (od lewej) ● pomiaru odległości pomiędzy wybranymi atomami; ● pomiaru kąta pomiędzy wiązaniami tworzonymi przez trzy atomy; ● mierzy kąty omega, psi i fi dla wybranego aminokwasu (użyte razem z klawiszem Ctrl umożliwia wybór 4 atomów i pomiar kąta skręcenia wiązania); ● narzędzie identyfikujące wybrany atom (jego współrzędne, przynależność do cząsteczki, aminokwas i jego numer kolejny); ● wyświetla bądź ukrywa grupy będące w zadanej odległości od wybranego atomu; ● przesuwa cząsteczkę ustawiając wybrany atom w centrum okna; ● dopasowuje dwie cząsteczki do siebie (działa tylko wtedy, kiedy cząsteczki wyodrębnione są w oknie Layers Infos); ● narzędzie wprowadzania mutacji, zamienia wybrany aminokwas na inny (pozwala też na wybór rotameru wybranego aminokwasu oraz oblicza dopasowanie energetyczne; najniższa wartość score oznacza najbardziej uprzywilejowaną konformację); ● okno umożliwiające zmianę kąta skrętu wybranego aminokwasu lub całej grupy (oblicza też dopasowanie energetyczne).
3. Z rozwijanego menu wybrać kolejno:
Window -> Control Panel;
Window -> Alignment;
Window -> Layers Infos.
Okno Control Panel podzielone jest na kolumny:
group – zawiera podkolumny (od lewej): ● litery oznaczające łańcuchy, wersalikami i małymi literami oznacza się odpowiednio łańcuchy...
Polciar