Metody oznaczania markerow nowotworowych.pdf

2009-05-10

CHOROBY NOWOTWOROWE

KOMÓRKI NOWOTWOROWE

Komórki, które uległy transformacji nowotworowej.

• Nowotwór zaczyna się rozwijać, gdy:

– komórki zaczynają wymykać się spod kontroli

mechanizmów decydujących o jej podziałach i

lokalizacji

• zmiany w błonie komórkowej :

–zwiększenie transportu metabolitów

–zwiększenie tworzenia pęcherzyków błonowych

– wzrost ruchliwości białek błonowych

• zmiany adhezyjne:

– zmniejszenie adhezji powierzchniowej

– zmian w organizacji włókien aktynowych

– zanik struktur fibronektynowych

zanik struktur fibronektynowych

– nadprodukcja aktywatora plazminogenu

Æ zmniejszenie zdolności do przylegania do siebie i do białek macierzy zewnątrzkomórkowej

• zmiany we wzroście i podziałach komórki:

– spadek zapotrzebowania na czynniki wzrostowe

– nabycie zdolności do wzrostu w zawiesinie

– nabycie zdolności do nieograniczonej proliferacji (immortalizacja)

• W normalnych warunkach Æ

– równowaga pomiędzy tempem podziałów komórek

gp ę ypp

a ubytkiem komórek

• Nowotwory

– zachwianie równowagi

(więcej komórek przybywa niż ginie)

– powstają w wyniku neoplazji

Większość zmian ma charakter ilościowy.

Dopiero nabycie zdolności do inwazji (naciekania) oraz kolonizacji tkanek

normalnie zajmowanych przez inne typy komorek ( Æ przerzuty ) powoduje,

że stają się one zagrożeniem dla całego organizmu.

CECHY KOMÓREK NOWOTWOROWYCH

1. Zdolność do nadmiernych, niekontrolowanych podziałów na

skutek:

– autokrynnej regulacji wzrostu (produkcja własnych czynników

wzrostowych przez komórki nowotworowe)

– ignorowaniu systemów kontrolujących namnażanie się komórkek

prawidłowych

– rozregulowaniu procesu proliferacji (między innymi

"prowokowanie" komórki przez zmutowane białka będące

4. Immortalizacja (nie we wszystkich przypadkach)

czyli uzyskanie zdolności do nieograniczonego przeżywania i

wzrostu, "nieśmiertelność" komórek (związana między innymi z

brakiem reakcji na czynniki wywołujące apoptozę).

prowokowanie komórki przez zmutowane białka będące

produktami onkogenów do stałych podziałów)

5. Brak różnicowania się funkcjonalnego

czyli komórka wskutek nadmiernej proliferacji oraz mutacji

czyli komórka wskutek nadmiernej proliferacji oraz mutacji,

które zaszły w DNA traci zdolność spełniania właściwych sobie

funkcji, zaczyna produkować białka nieprawidłowe lub też

prawidłowe, lecz w zdecydowanym nadmiarze.

2. Brak zahamowania kontaktowego

czyli charakterystycznego dla prawidłowych tkanek dystansu

pomiędzy komórkami.

6. Zdolność do tworzenia przerzutów (metastaz)

czyli odłączanie się od nowotworu, wchodzenie do naczyń

krwionośnych lub limfatycznych i krążenie w krwioobiegu, a

następnie atakowanie innych tkanek i zapoczątkowanie

nowych skupisk nowotworowych.

3. Inwazyjność

czyli zdolność do atakowania sąsiadujących komórek

prawidłowych oraz zajmowania i przerastania ich terytoriów.

ETAPY KANCEROGENEZY

PREINICJACJA

1. EKSPOZYCJA NA CZYNNIKI

KANCEROGENNE Æ PREINICJACJA

• Ekspozycja na czynniki kancerogenne:

– fizyczne: promieniowanie jonizujące, UV

– chemiczne: konserwanty, barwniki

– biologiczne: wirusy, bakterie, pasożyty

• Predyspozycje genetyczne tj.

sprawność metabolizowania kancerogenów polimorfizm genów

– sprawność metabolizowania kancerogenów, polimorfizm genów

kodujących mechanizmy naprawcze.

URUCHOMIENIE PROCESU

TRANSFORMACJI NOWOTWOROWEJ Æ

INICJACJA

uszkodzenie DNA

3. SELEKCJA KLONALNA – NABYCIE

ZDOLNOŚCI DO TWORZENIA

PRZERZUTÓW Æ PROGRESJA

aktywacja

punktów

kontrolnych

apoptoza

aktywacja programów

transkrypcyjnych

aktywacja programów

naprawczych

KOMÓRKI NOWOTWOROWE

neoplazji (rozrostu) komórek,

– utrata kontroli nad proliferacją (wynika z

niestabilności genetycznej komórki)

2. NAGROMADZENIE MUTACJI I

URUCHOMIENIE PROCESU

2009-05-10

INICJACJA

• Pojawienie się mutacji spontanicznej lub odziedziczonej

(gł. w jednym z mechanizmów naprawczych DNA):

PROGRESJA

• przekształcenie się komórki normalnej w

nowotworową

• rozrost (tworzenie guza)

• utworzenie dróg inwazji poprzez rozwój

naczyń krwionośnych ( angiogeneza Æ

źródło składników odżywcze i wzrostowe)

•rozluźnienie struktury guza

• selekcja klonów komórek, których produkty

umożliwiają szybki rozrost i tworzenie

nacieków Æ utrata wł. adhezyjnych, wzrost

poziomu enzymów proteolitycznych

lizujących błonę podstawną

•przełamanie bariery białek macierzy

zewnątrzkomórkowej, uwalnianie komórek

z guza i przemieszczanie do innych tkanek

– uszkodzenie genów kontrolujących podziały komórkowe np.

gen p53 (białko p53 reguluje przebieg apoptozy i cyklu

komórkowego

– niesprawne mechanizmy naprawcze

– blokada procesu apoptozy

– ucieczka przed mechanizmami układu immunologicznego

• Jedna mutacja nie jest wystarczająca do transformacji

nowotworowej, potrzebny tzw. szlak mutacyjny.

ANGIOGENEZA

Ag NOWOTWOROWE

U wielu osób z rozwijającym się nowotworem obserwuje się aktywność immunol.

przeciwko kom. nowotworowym

- Ab anty-komórki nowotworowe

- zdolność limfocytów chorego do odpowiedzi na Ag nowotworowe

1) Istnieją Ag nowotworowe

2) Uzasadnione są próby immunoterapii nowotworów

PROBLEM:

większość Ag nowotworowych

Æ nie ma charakteru Ag swoistych (powstają spontanicznie)

Æ czasem występuje w niewielkich ilościach na niektórych komórkach prawidłowych

TAA (Tumor Associated Antigens)

PODZIAŁ Ag NOWOTWOROWYCH

Ag NOWOTWOROWE

Cel badania Ag nowotworowych: a) Wykrywanie

b) Monitorowanie

c) Leczenie

• Brak lub niska swoistość Ag nowotworowych.

–nie wyklucza możliwości wykorzystania ich do wykrywania nowotworów

i monitorowania leczenia

1) Ag powszechnie występujące

- obecne na komórkach nowotworowych i różnych komórkach

prawidłowych

- fragmenty telomerazy

• Niekiedy Ab przeciw Ag nowotworowym mogą indukować

zniszczenie komórek nowotworowych (duże stężenie Ag) i

dić”k óki idł ( i j t ż iA)

„oszczędzić” komórki prawidłowe (mniejsze stężenie Ag).

2) Ag różnicowania

- obecne na komórkach nowotworowych i prawidłowych komórkach, z

których wywodzi się nowotwór

- CAE, PSA, Ag czerniaka (gp100, MART-1)

• TAA występuje poza nowotworem tylko na nielicznych komórkach

prawidłowych (ich uszkodzenie podczas terapii nie spowoduje

poważnych efektów ubocznych) (komórki nowotworowe czerniaka a

bielactwo – niszczenie melanocytów).

3) Ag rakowo-jądrowe

- oprócz komórek nowotworowych występują na spermatocytach i

spermatogoniach

4) Ag swoiste dla nowotworu TSA (Tumor Specific Antiens)

-występują tylko na komórkach zmienionych nowotworowo

Nowotwory człowieka w większości nie zawierają TSA !!! wyjątki

• Niekiedy brak swoistych Ag może być atutem.

Ag obecny na komórkach czerniaka i limfocytach B.

INICJACJA

TAA (Tumor Associated Antigens)

2009-05-10

Ag NOWOTWOROWE

PODZIAŁ Ag NOWOTWOROWYCH

W rozpoznawaniu Ag nowotworowych uczestniczą:

Ag indukowane przez onkogeny - onkogenne DNA i RNA wirusów

kodują powierzchniowe i jądrowe Ag wirusowe, które ulegają

ekspresji w komórce lub na jej powierzchni zmieniając ją

nowotworowo. Ag takie występują we wszystkich komórkach

zakażonych przez te same wirusy. Np. wykazano zależność

pomiędzy zakażeniem wirusem Hepatitis B a nowotworami wątroby

pomiędzy zakażeniem wirusem Hepatitis B a nowotworami wątroby.

1) limfocyty T CD4+ (Ag złuszczane z kom.) i CD8+ (im bardziej

złośliwy nowotwór, tym mniejsza ekspresja MHC kl. I na pow.

kom. nowotworowej)\

2) Ab

)

CD19-CD22 wyst. na pow. chłoniaków z limfocytów B,

alfafetoproteina (AFP) –rak wątroby i jądra (prawidłowa

wątroba, pęcherzyk żółciowy, przewód pokarmowy)

PSA (Prostate Specific Antigen) – Ag swoisty dla

gruczołu krokowego

Ag indukowane przez substancje chemiczne -związki chemiczne

indukują przypadkowe mutacje DNA, co może prowadzić do indukcji

ekspresji Ag nowotworowych.

3) limfocyty T i Ab np. zespół Ag karcynoembrionalnych CEA

rak jelita grubego, trzustki, żołądka

rzadziej płuc, sutka, trzonu macicy

ODPOWIEDŹ PRZECIWNOWOTWOROWA

TERAPIA NOWOTWORÓW

• Leczenie chirurgiczne

• Chemioterapia

• Radioteprapia

• Immunoterapia - uzupełnia ww. metody leczenia:

– czynna

czynna - efekt leczniczy uzyskuje się poprzez wzmożenie reaktywności układu

immunologicznego pacjenta. Obejmuje:

di k t hl bi hA ti i i

•podanie kom. nowotworowych lub ich Ag w postaci szczepionki

Æ czynna terapia swoista

•aktywac ę mechanizmów immunologicznych za pomocą preparatów

immunostymulujących

Æ czynna terapia nieswoista.

(Efekt jest wynikiem bezpośredniego działania cytokin na kom. nowotworowe)

–– bierna

bierna - podawanie mAb przeciwko Ag nowotworowym, stosuje się Ab

zmodyfikowane np. enzymami w celu zwiększenia ich skuteczności.

– adoptywna

adoptywna - podanie dożylne lub miejscowe kom. immunologicznych pacjenta

aktywowanych Ag nowotworowymi poza organizmem gospodarza.

–– pośrednia

pośrednia - blokowanie czynników wzrostu lub angiogenezy.

Mechanizmy efektorowe odpowiedzi

immunologicznej:

• aktywność komórek NK

• cytotoksyczność komórek zależna od

Ab (ADCC)

• cytotoksyczność Ab zależna od

dopełniacza (kompleks Ag-Ab Æ

aktywacja dopełniacza Æ liza komórki)

• cytotoksyczność limfocytów CTL

• cytotoksyczość pobudzonych makrofagów i neutrofilów

• aktywność cytokin wydzielanych przez makrofagi i limfocyty T

helper

SZCZEPIONKI

PRZECIWNOWOTWOROWE

SZCZEPIONKI

PRZECIWNOWOTWOROWE

• Powinny wykazywać działanie lecznicze, nie profilaktyczne.

• Najbardziej przydatne w leczeniu nowotworów zdolnych do indukcji

odp. immunologicznej o dobrze określonych i swoistych Ag np.

czerniak.

•Mogą zawierać:

– odpowiednio przygotowane - zabite napromieniowane - komórki

• Skuteczność szczepionek jest stosunkowo niska,

– ponieważ w czasie od momentu pobrania komórek nowotworowych od

pacjenta do momentu podania szczepionki, nowotwór rozwija się i ulega

zmianom, więc nie są to już te same komórki użyte do szczepionki.

odpowiednio przygotowane zabite, napromieniowane komórki

nowotworowe auto- i allogeniczne lub ich Ag podawane łącznie z

adiwantami (BCG, zw. glinu) lub cytokinami (IL-2, IL-12)

– zmodyfikowane metodami inżynierii genetycznej kom. nowotworowe, do

których DNA wprowadzono określone geny: IL-2, IL-4, IL-7, TNF, IFN- γ

lub geny dla cząsteczki kostymulującej CD80 niezbędnej w procesie

prezentacji Ag

– drobnoustroje wewnątrzkomórkowe np. adenowirusy lub Listeria

monocytogenes z wprowadzonymi genami dla Ag nowotworowych Æ

skuteczna prezentacja

– komórki dendrytyczne (KD), które jako cząsteczki APC są niezbędne do

inicjacji odp. Immunologicznej.

Szczepionka profilaktyczna

– podawana osobom z grup ryzyka.

– źródłem komórek nowotworowych mogą być hodowle komórek o dobrze

sprecyzowanych Ag lub komórki nowotworowe rodziny.

– wzbudzenie odpowiedzi immunologicznej skutkuje wytworzeniem

limfocytów pamięci immunologicznej.

– w chwili rozwoju nowotworu od razu są gotowe mechanizmy odporności

przeciwnowotworowej, które nie doprowadzą do różnicowania komórek i

zniszczą je zanim ulegną modyfikacjom.

• Ag indukowane przez onkogeny

• Ag indukowane przez substancje chemiczne

TERAPIA NOWOTWORÓW

SZCZEPIONKI

• Szczepionka profilaktyczna

2009-05-10

otrzymuje się

pojedyńcze

komórki rakowe

poddaje się je

promieniowaniu X

(zahamowanie

proliferacji)

Przeciwciała

monoklonalne

guz usunięty

chirurgicznie

monoklonalne mAb

mAb

wprowadzenie

genu dla

cytokin

wprowadzenie

komórek do

organizmu

pacjenta

rozpoznanie

Ag przez KD

• poddane modyfikacjom:

–połączone z toksynami np. dyfterotoksyna

–połączone z lekami cytotoksycznymi

– połączone z enzymami przekształcającymi leki p-nowotworowe z formy

p ą y

(podskórne lub

dożylne)

nieaktywnej (prolek) w aktywną (lek)

– znakowane radioizotopami np. jod 131

– Ab o podwójnej swoistości Æ 1 ramię jest skierowane do Ag

nowotworowego, a 2 ramię ma zdolność rozpoznawania CD3 limfocyta

Æ aktywacja komórek efektorowych

ją y

swoiste

limfocyty,

których

aktywność jest

skierowana

przeciwko

komórkom guza

aktywacja

limfocytów T/B

eliminacja komórek

nowotworowych

DIAGNOSTYKA NOWOTWORÓW

Ma na celu:

–określenie pochodzenia nowotworu

– oznaczenie etapu różnicowania komórki zdrowej

–określenie progresji nowotworu u chorego

– poszukiwanie przerzutów i ich umiejscowienia

Metody:

• mikroskopia świetlna, elektronowa

• immunofenotypowanie

– badanie antygenów przy zastosowaniu specyficznych przeciwciał

– metoda ELISA

– metoda cytometrii przepływowej

– metoda radioimmunologiczna

• cytogenetyka

• biologia molekularna

–PCR Æ umożliwia in vitro amplifikację wybranych sekwencji DNA przy

użyciu polimerazy DNA i syntetycznych oligonukleotydów (tzw. starterów)

komplementarnych do końców wybranych sekwencji DNA

– RT - PCR (reverse transcription PCR) Æ modyfikacja reakcji PCR do

wykrywania i analizy cząsteczek RNA

• analiza biochemiczna

Cancer-killing vaccinia virus (a smallpox relative, in green)

spreading through 3-D cultured tumor cells (red).

Image: Courtesy of Stephen Thorne

ELISA Technique

•After washing to remove unbound serum constituents

•An enzyme-labelled 2 sd Ab anti Ag (from patient serum) is added

• serum is incubated in wells which have been coated with purified Ab

Negative control

Sample-low concentration

Sample-high concentration

Negative control

Sample-low concentration

Sample-high concentration

Przeciwciała

2009-05-10

• Enzyme-labelled Ab is visualised by addition on a chromogenic

enzyme substrate

• colour development is proportial to the concentration of Ab in the

test serum – measured spectrophotometrically

Immunofluorescence

Negative control

Sample-low concentration

Sample-high concentration

Fluorescence – emision of light of one

color while a substance is irradiated

with light of different color.

PCR, RT --PCR

PCR

UV light

• analiza DNA lub RNA tkanki guza

• diagnoza

• prognoza

• zapewnia wykrywanie:

• śladowych ilości materiału guza (1 komórki nowotworowej)

śladowych ilości materiału guza (1 komórki nowotworowej)

• ekspresji genów związanych z nowotworem

• rearanżacji genów immunoglobulin

• amplifikacji onkogenów, np. myc - N

• mutacji genu supresorowego p53

• wysoka czułość metody

• bardzo czuła i bardzo szybka diagnoza

• monitorowanie choroby

• wykrywanie choroby resztkowej przy remisji cytomorfologicznej

Zasada działania reakcji PCR

Krok 1 - Denaturacja (94 ° C)

W wyniku ogrzewania dochodzi do rozplecenia podwójnej helisy DNA.

Krok 2 – Przyłączanie starterów (60 ° C)

Dodanie jednoniciowych primerów które łączą się z DNA którego

poszukujemy (primery łączą się z jednoniciowym DNA ze względu na

komplementarność).

PCR, RT

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: