metody oznaczania Ab i dopelniacza.pdf

(1105 KB) Pobierz

metody oznaczania Ab i dope³niacza

Metody oznaczania Ab i skł. dopełniacza

¡ Antygen (Ag) - makrocząsteczka obca w stosunku do organizmu, do

którego wnika, pobudzająca układ immunologiczny do odpowiedzi:

• humoralnej - swoiste przeciwciała

• komórkowej - swoiste komórki efektorowe

Cechy Ag:

– immunogenność: zdolność do wzbudzania odpowiedzi organizmu

– antygenowość: zdolność do reagowania ze wzbudzonymi przez

siebie komórkami lub przeciwciałami

Podział Ag:

1.

– grasicozależne - wymagają obecności limfocytów T dla aktywacji

limfocytów B do produkcji Ab. Powstają głównie Ab IgG (wysoka

swoistość), wzbudzają dobrą pamięć immunologiczną,

– grasiconiezależne - bezpośrednio aktywują limfocyty B, powstają

Ab IgM (niska swoistość), wzbudzają słabą pamięć

immunologiczną. Superantygeny.

¡ Przeciwciała (Ab) - białka należące do frakcji gammaglobulin

syntetyzowane przez komórki plazmatyczne (pobudzone limfocyty B)

w przebiegu odpowiedzi immunologicznej, swoiste dla

rozpoznawanego Ag.

Schemat przeciwciała:

1. fragment wiążący antygen

2. region Fab

3. region Fc

niebieskie - łańcuchy ciężkie

żółte - łańcuchy lekkie

ciemnoniebieskie/żółte - regiony

zmienne

jasnoniebieskie/żółte - regiony

stałe

szare - mostki dwusiarczkowe

Powinowactwo (ang. affinity)

cecha, która określa siłę

wiązania pomiędzy

pojedynczym epitopem a

pojedynczym miejscem

wiązania przeciwciała .

Zachłanność (ang. avidity )

wiązanie się Ab z całą

cząsteczką Ag

wielodeterminantowego.

2.

– cząstkowe (korpuskularne) - silnie immunogenne, całe komórki,

wirusy

– rozpuszczalne - słabo immunogenne, toksyny, białka, LPS,

DNA/RNA

¡ Przeciwciała monoklonalne (mAb) - skierowane przeciwko jednej

determinancie antygenowej (determinanta=epitop, miejsce wiązania Ag

z Ab)

METODY OZNACZANIA PRZECIWCIAŁ

Testy immunoenzymatyczne

Testy aglutynacyjne

Testy precypitacyjne i immunodyfuzji

Metody immunoelektroforetyczne

TECHNIKI

IMMUNOENZYMATYCZNE

Testy immunofluorescencyjne

Ab

Ag

KI

ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

ej , ale nie jest

pierwszym, który zosta ł wynaleziony, chocia ż jest jednym z najcz ęś ciej

stosowanych.

testó w fazy sta

w fazy sta ł ej

¡ test immunoenzymatyczny lub i mmunoenzymosorbcyjny , jest

jednym z najpowszechniej stosowanych testów w badaniach

biomedycznych, zarówno naukowych, jak i diagnostycznych

¡ W metodzie ELISA stosuje się 96- dołkową płytkę płaskodenną

wykonaną z syntetycznych polimerów. Czułość tej metody dorównuje

metodzie RIA, a jest znacznie tańsza, prostsza i nie naraża na kontakt

substancjami radioaktywnymi.

¡ Służy do:

– wykrywania i określania stężeń leków, hormonów, enzymów, nawet

jeżeli występują one w bardzo małych ilościach w płynach

tkankowych

– do oceny odporności humoralnej (ocena stężenia immunoglobulin w

surowicy), układu dopełniacza (określenie stężenia poszczególnych

jego składników)

– rutynowo stosuje się w diagnostyce wirusa CMV, HIV, rozpoznaniu

WZW A itp.

– może też być stosowany do wykrywania alergenów pokarmowych tj.

mleko, jajka, orzeszki ziemne, migdały, w przemyśle spożywczym

ELISA

¡ Test ELISA nale ż y do szerszej grupy tzw. test

30961470.066.png

30961470.077.png

30961470.088.png

30961470.099.png

30961470.001.png

30961470.012.png

30961470.018.png

30961470.019.png

30961470.020.png

30961470.021.png

30961470.022.png

30961470.023.png

30961470.024.png

30961470.025.png

30961470.026.png

30961470.027.png

30961470.028.png

30961470.029.png

30961470.030.png

30961470.031.png

30961470.032.png

30961470.033.png

30961470.034.png

30961470.035.png

30961470.036.png

30961470.037.png

30961470.038.png

30961470.039.png

30961470.040.png

30961470.041.png

30961470.042.png

30961470.043.png

30961470.044.png

30961470.045.png

30961470.046.png

30961470.047.png

30961470.048.png

30961470.049.png

30961470.050.png

30961470.051.png

30961470.052.png

30961470.053.png

30961470.054.png

30961470.055.png

30961470.056.png

30961470.057.png

30961470.058.png

30961470.059.png

30961470.060.png

30961470.061.png

30961470.062.png

30961470.063.png

30961470.064.png

30961470.065.png

30961470.067.png

30961470.068.png

30961470.069.png

30961470.070.png

30961470.071.png

30961470.072.png

30961470.073.png

30961470.074.png

30961470.075.png

30961470.076.png

30961470.078.png

30961470.079.png

30961470.080.png

30961470.081.png

30961470.082.png

30961470.083.png

30961470.084.png

30961470.085.png

30961470.086.png

30961470.087.png

30961470.089.png

30961470.090.png

30961470.091.png

30961470.092.png

30961470.093.png

30961470.094.png

30961470.095.png

30961470.096.png

30961470.097.png

30961470.098.png

30961470.100.png

30961470.101.png

30961470.102.png

30961470.103.png

30961470.104.png

Metody oznaczania Ab i skł. dopełniacza

¡ ETAPY TESTU ELISA

1. Opłaszczanie przeprowadza się

przez dodanie do studzienki

antygenu przeznaczonego do

umieszczenia na fazie stałej.

Całość jest następnie inkubowana

przez określony czas, najpierw

zwykle w temperaturze 37°C, a

potem 4°C, cho ć możliwe są także

inne metody, co zależy od

przeprowadzanego badania.

Temperatura jest jednym z

najważniejszych czynników, nie

może jednak przekroczyć 56°C,

gdyż w przypadku białek dojdzie do

denaturacji.

2. Po przeprowadzeniu opłaszczenia

należy jeszcze zablokować miejsca

niezajęte przez antygen. Dokonuje

się tego za pomocą czynników

blokujących, np. roztworu

owoalbuminy lub odtłuszczonego

mleka, co zapobiega

nieselektywnemu przyłączaniu się

białek do fazy stałej podczas

następnych etapów testu,

wymagających także inkubacji w

określonych temperaturach.

¡ ELISA to technika biochemiczna stosowana do wykrywania

obecności Ab lub Ag w badanych próbach. Możemy zastosować

metodę pośrednią (2) lub bezpośrednią (1). W metodzie

bezpośredniej stosujemy tylko jeden rodzaj Ab, które są znakowane

natomiast w pośredniej pierwsze Ab swoiste do Ag nieznakowane i

drugie Ab znakowane enzymem swoiste do pierwszych przeciwciał.

3. Następnie dodajemy

do studzienek płytki

próby surowicy w której

będziemy wykrywać

obecność Ab swoistych

do opłaszczonych Ag.

4. Dodajemy Ab

znakowane ezymem

skierowane przeciwko

ludzkim przeciwciałom.

Kompetycyjny (rywalizacyjny) test ELISA

(c-ELISA, z ang. competitive ELISA)

¡ Stosuje się mieszankę znakowanego Ab, która jest dodawana do

badanego materiału.

¡ Podobnie jak w innych typach ELISA mierzących stężenie Ab, faza

stała jest opłaszczona odpowiednim Ag.

¡ Jeśli na fazę stałą podziałamy mieszanką badanej surowicy i

specyficznego względem danego antygenu mAb wyznakowanego

enzymem, to nastąpi współzawodnictwo pomiędzy przeciwciałami w

surowicy, a przeciwciałem znakowanym.

5. Nanosimy substrat

dla enzymu np..

chromogen.

¡ W odróżnieniu od poprzedniej metody natężenie reakcji enzymatycznej

będzie odwrotnie proporcjonalne do stężenia przeciwciał w surowicy ã

im większe będzie ich stężenie, tym mniej znakowanego przeciwciała

przyłączy się do antygenu umieszczonego na fazie stałej.

6. Odczytujemy wyniki

na spektrofotometrze.

UniCAP

¡ technologia ImmunoCAP została

przedstawiona przez Pharmacia w

1989r.

¡ całkowicie zautomatyzowany

¡ wysokie standardy prowadzenia badań

¡ wynik uzyskuje się zwykle w ciągu 2,5

godz.

¡ urządzenie przechowuje krzywą

kalibracyjną

¡ automatyczna kalkulacja wyników

METODY OPARTE NA

REAKCJI AGLUTYNACJI

ImmunoCAP sIgE

test in-vitro mierzy poziom alergenowoswoistych IgE w plazmie lub

surowicy pacjentów, co umożliwia ocenę uwrażliwienia pacjenta na dany

alergen. ImmunoCAP pozwala na ilościową ocenę szerokiego rodzaju

alergenów – ponad 550, pozwala przewidzieć ryzyko rozwoju alergii w

przyszłości, swoistość testu 85-94%

30961470.105.png

30961470.106.png

30961470.107.png

30961470.108.png

30961470.109.png

30961470.002.png

Metody oznaczania Ab i skł. dopełniacza

¡ Aglutynacja

– reakcja zachodząca pomiędzy swoistymi Ab a Ag cząstkowymi

(wchodzącymi w skład otoczek komórek bakteryjnych, grzybów,

erytrocytów, komórek ludzkich i zwierzęcych)

– może zachodzić między swoistymi Ab a Ag rozpuszczalnym

opłaszczonym na cząsteczkach lateksu

– komórki z przyłączonymi Ab tworzą przestrzenne agregaty

wypadające z roztworu w postaci aglutynatu

¡ Aglutynacja jest odczynem stosowanym w chorobach zakaźnych,

wywoływanych przez bakterie, nie ma natomiast zastosowania w

chorobach wirusowych.

¡ Teoretycznie można go stosować wszędzie tam, gdzie wyhoduje się

drobnoustrój, z którego można sporządzić antygen.

¡ Zaletą odczynu jest prostota jego wykonania, szybkość wystąpienia

reakcji, łatwość odczytania wyników i stosunkowo wysoka czułość.

¡ Hemaglutynacja

– aglutynacja czerwonych krwinek

– hemaglutynacja bezpośrednia , czyli czynna, w której zlepianie

erytrocytów wywoływane jest przez różne drobnoustroje. To zjawisko

może zostać zahamowane działaniem surowicy zawierającej swoiste

przeciwciała skierowane przeciwko drobnoustrojom zlepiającym

krwinki

– hemaglutynacja pośrednia , czyli bierna, zachodzi wówczas, gdy na

erytrocyty opłaszczone jakimś antygenem zadziałamy surowicą

odpornościową, zawierającą przeciwciała swoiste dla antygenu

zaadsorbowanego na powierzchni krwinki.

Zastosowanie metody aglutynacji

¡ w identyfikacji Ag powierzchniowych komórek

¡ do wykrywania Ag w badanych surowicach

¡ do oznaczania poziomu Ab w surowicy przez

wyznaczenie miana aglutynacyjnego

Miano aglutynacyjne jest to największe rozcieńczenie surowicy

badanej (lub najmniejsze stężenie Ag), przy którym widoczne

są jeszcze aglutynaty.

A

0

B

Oznaczanie grup krwi z

zastosowaniem krwinek

wzorcowych – materiałem

od pacjenta jest surowica

( ã szukamy Ab)

30961470.003.png

30961470.004.png

30961470.005.png

Metody oznaczania Ab i skł. dopełniacza

¡ Precypitacja

METODY OPARTE NA

REAKCJI PRECYPITACJI

– reakcja między cząsteczką Ab swoistego a Ag rozpuszczalnym (o

masie cząsteczkowej 40-160kDa) zachodząca w środowisku

płynnym

– 1 faza: Ag reaguje z Ab i powstają kompleksy immunologiczne (KI)

– 2 faza: powstałe KI w środowisku elektrolitów wypadają w postaci

precypitatów widocznych gołym okiem

– Ag i Ab łączą się ze sobą w różnych stosunkach ilościowych, do

powstania kompleksów widocznych gołym okiem dochodzi w strefie

ekwiwalencji , czyli strefie równowagi stężeń obu reagentów

– przed nastawieniem reakcji precypitacji należy pamiętać o

inaktywacji surowicy , ze względu na obecność dopełniacza, który

może rozpuszczać KI. Inaktywacja zachodzi w temp. 56°C przez 30

min.

¡ Immunodyfuzja

– reakcja precypitacji zachodząca w środowisku żelowym

– oparta jest na zjawisku dyfuzji cząsteczki Ag i Ab w żelu

– precypitat powstaje w strefie ekwiwalencji w miejscu zetknięcia się

obu reagentów, widoczny w postaci linii, łuków lub pierścienia

precypitacyjnego

– szybkość dyfuzji reagentów w żelu jest odwrotnie proporcjonalna

do wielkości cząsteczki i wprostproporcjonalna do stężenia

reagentów

– stosuje się zwykle 1-2% żel agarowy lub agarozowy jako środ.

reakcji, który pozwala na swobodną dyfuzję

– zależy od takich samych czynników co precypitacja probówkowa

– dwa typy immunodyfuzji:

• pojedyńcza – dyfunduje tylko jeden z reagentów (zwykle Ag),

a drugi z nich (Ab) występują w żelu w jednakowym stężęniu

• podwójna – zarówno Ag i Ab dyfundują w żelu

– można wykonywać w probówkach i na płytkach

IMMUNOELEKTROFOREZA

¡ Elektroforeza białek jest metodą rozdziału białek występujących we

krwi (w surowicy) lub w moczu.

METODY

IMMUNOELEKTROFORETYCZNE

¡ Podczas badania prąd elektryczny użyty jest do poruszania się białek w

cienkiej warstwie agaru o konsystencji żelu.

¡ Odległości jakie pokonują białka zależą od ich wielkości, kształtu i

ładunku elektrycznego.

30961470.006.png

30961470.007.png

Metody oznaczania Ab i skł. dopełniacza

¡ Immunoelektroforeza jest używana do jakościowych analiz mieszanin

antygenów, może jednak stanowić również pewien wskaźnik ilościowy

(grubość łuków i linii precypitacyjnych).

¡ Test ten jest powszechnie używany do analizy składowych surowicy

pacjenta ã surowica jest umieszczana w wyciętym dołku, a

przeciwciało do całej surowicy w korytku. Poprzez porównanie z

„normalną” surowicą można ocenić czy widoczne są różnice – brak

białka, jego niedobór lub nadmiar.

¡ Test może być również wykorzystany do oceny czystości

wyizolowanych białek surowicy.

IMMUNOFLUORESCENCJA

¡ Testy immunofluorescencyjne

¡ Stosuje się dwa warianty metody immunofluorescencji (IF):

– są standardową techniką immunologiczną (gold standard) w

diagnostyce przeciwciał przeciwbakteryjnych,

przeciwwirusowych a także skierowanych przeciw tkankom

organizmu, komórkom i ich częściom

– charakteryzuje się wysoką czułością i swoistością

– wykorzystują przeciwciała znakowane barwnikami

fluorescencyjnymi

– do najczęściej stosowanych

barwników należy izotiocyjanian

fluoresceiny (FITC), który po

wzbudzeniu emituje kolor zielony oraz

izotiocyjanian tetrametylorodaminy

(TRITC), który po wzbudzeniu emituje

kolor czerwony

– źródłem antygenów są substraty

tkankowe pozwalające na wykrywanie

szerokiego spektrum przeciwciał

– Testy immunofluorescencyjne bezpośrednie wykrywają przy

pomocy znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał określony

antygen.

– Testy immunofluorescencyjne pośrednie wykrywają przy

pomocy znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał

immunoglobuliny, które uprzednio związały się ze swoistym

antygenem.

Diagnostyka kiły - Test immunofluorescencji pośredniej

Diagnostyka kiły - Test immunofluorescencji pośredniej c.d.

¡ Na szkiełko podstawowe nanosi się krętki kiły Treponema

pallidum (krętki pochodzą z laboratorium)

¡ Po przepłukaniu, dodaje się przeciwciała swoiste wobec ludzkich

immunoglobulin. Przeciwciała te znakowane są barwnikiem

fluorescencyjnym.

¡ Dodaje się surowicę pacjenta

Jeśli surowica badanej osoby zawiera przeciwciała swoiste wobec

krętków (tj. zaraziła się kiłą), to zwiążą się one z krętkami na szkiełku

¡ Wynik pozytywny ã osoba zarażona ã pod mikroskopem

fluoresencyjnym obserwuje się fluoryzujące krętki

¡ Wynik negatywny ã osoba „niezarażona” ã brak "świecenia"

30961470.008.png

30961470.009.png

30961470.010.png

30961470.011.png

30961470.013.png

30961470.014.png

30961470.015.png

30961470.016.png

30961470.017.png

Plik z chomika:

kosmetologia_umed

Inne pliki z tego folderu:

Immunologia_208_pytania.doc (28 KB)
izolacja, barwienie i roznicowanie komorek ukl. immunologicznego.pdf (2304 KB)
Metody oceny chemotaksji, fagocytozy..pdf (1724 KB)
metody oznaczania Ab i dopelniacza.pdf (1105 KB)
Metody oznaczania autoAb.pdf (1108 KB)

Inne foldery tego chomika:

Zgłoś jeśli naruszono regulamin