Hybrydyzacja, sondy, PCR.pdf

(614 KB) Pobierz
Microsoft PowerPoint - PCR [Tylko do odczytu]
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
Hybrydyzacja kwasów
nukleinowych
• Dwuniciowe cząsteczki kwasów
nukleinowych (DNA, RNA) ulegają
denaturacji pod wpływem czynników
takich jak wysoka temperatura, wysokie
pH (środowisko zasadowe), niektóre
substancje chemiczne (mocznik,
formamid, guanidyna) o działaniu
chaotropowym
Hybrydyzacja
kwasów
nukleinowych
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
5’ ACTCTAGTCTGAACAGTCTGATCGATG 3’
3’ TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC 5’
1
18925335.007.png 18925335.008.png
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
5’ ACTCTAGTCTGAACAGTCTGATCGATG 3’
5’ ACTCTAGTCTGAACAGTCTGATCGATG 3’
3’ TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC 5’
3’ TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC 5’
20 o C
95 o C
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
5’ ACUCUAGUCUGAACAGUCUGAUCGAUG 3’
5’ ACTCTAGTCTGAACAGTCTGATCGATG 3’
3’ TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC 5’
5’ ACTCTAGTCTGAACAGTCTGATCGATG 3’
3’ TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC 5’
20 o C
20 o C
2
18925335.009.png 18925335.010.png
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
5’ ACUCUAGUCUGAACAGUCUGAUCGAUG 3’
5’ ACTCTAGTCTGAACAGTCTGATCGATG 3’
5’ ACTCTAGTCTGAACAGTCTGATCGATG 3’
5’ ACUCUAGUCUGAACAGUCUGAUCGAUG 3’
3’ TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC 5’
3’ TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC 5’
95 o C
20 o C
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
5’ ACTCTAGTCTGAACAGTCTGATCGATG 3’
3’ TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC 5’
3
ll lll ll lll ll ll lll ll lll ll lll ll ll lll ll lll ll lll ll lll ll ll lll lll ll ll lll
18925335.001.png 18925335.002.png
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
5’ ACTCTAGTC G G C AC CTGA TGATCGATG 3’
5’ ACTCTAGTCTGAACAGTCTGATCGATG 3’
ll lll ll lll ll ll lll ll lll
lll
ll lll
ll lll ll ll lll lll ll ll lll
ll lll ll lll ll ll lll ll lll ll lll ll ll lll ll lll ll lll ll lll ll ll lll lll ll ll lll
3’ TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC 5’
3’ TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC 5’
Tm = 2 x n A-T +4 x n G-C
Tm = 78 o C
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
5’ ACTCTAGTC G G C AC CTGA TGATCGATG 3’
lll
ll lll
ll lll ll ll lll lll ll ll lll
• Tm - jest to tzw. odwracalny punkt
topnienia - temperatura przy której istnieje
równowaga dynamiczna pomiedzy hybrydami
rozpadającymi się w wyniku denaturacji i
tworzącymi się w wyniku renaturacji.
• Ze statycznego punktu widzenia w tej
temperaturze 50% hybryd ulega rozpadowi.
•Tm -zależy od wielu czynników: stężenia
jonów Na + , liczby par G-C, długości hybrydy,
stężenia formamidu, lub mocznika.
3’ TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC 5’
Tm = 2 x n A-T +4 x n G-C
Tm = 62 o C
4
ll lll ll lll ll ll lll ll lll
18925335.003.png
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
czynnik
5’ ACTCTAGTCTGAACAGTCTGATCGATG 3’
3’ TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC 5’
Na +
formamid
5’ ACUCUAGUCUGAACAGUCUGAUCGAUG 3’
3’ TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC 5’
% G-C
5’ ACUCUAGUCUGAACAGUCUGAUCGAUG 3’
3’ UGAGAUCAGACUUGUCAGACUAGCUAC 5’
długość
Hybrydy DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA
Ich stabilność jest zróżnicowana: RNA-RNA>DNA-RNA>DNA-DNA
Sondy molekularne
Sondy molekularne
Barwnik fluorescencyjny
Znakowanie
5’ GUCUGAACAGUCUGA 3’
3’ TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC 5’
Izotopy
Barwniki
Enzymy
14 C
Fluoresceina
Peroksydaza
Izotop promieniotwórczy
3 H (tryt)
Rodamina
Fosfataza
5’ GUCUGAACAGUCUGA 3’
3’ TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC 5’
35 S
Texas Red
Oksydaza
Enzym
33 P
Cy3
5’ GUCUGAACAGUCUGA 3’
3’ TGAGATCAGACTTGTCAGACTAGCTAC 5’
32 P
Cy7 (IR)
5
18925335.004.png 18925335.005.png 18925335.006.png
 

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika:

Zgłoś jeśli naruszono regulamin