2
E N Z Y M Y
1. Enzymy - biokatalizatory - przyspieszają osiągnięcie stanu równowagi reakcji, których zajście z termodynamicznego punku widzenia jest możliwe. Uczestnicząc w przekształcaniu substratu w produkt same nie zużywają się w trakcie reakcji:
a/ znakomita większość znanych dziś enzymów to białka globularne, część z nich
wymaga współpracy z kofaktorami, którymi są drobnocząsteczkowe związki
organiczne mocno wiązane przez enzym - grupy prostetyczne (1), wiążące się z nim
przejściowo w toku reakcji i pełniące często rolę kosubstratów - koenzymy(2) a
także jony metali(3).
b/ w ostatnich dwudziestu latach odkryto, że niektóre kwasy rybonukleinowe mają
również właściwości katalityczne, nazwano je rybozymami, uczestniczą one jednak
tylko w szeroko pojętym procesie ekspresji genu, nie stwierdzono natomiast udziału
rybozymów w podstawowym metabolizmie, którego przebieg jak i forma życia jaką
znamy nie byłyby możliwe bez udziału typowych enzymów białkowych.
2. Kinetyka reakcji chemicznych i czynniki warunkujące jej przebieg:
a/ definicja szybkości reakcji: v = ± dc/dt º - d[S]/dt = d[P]/dt
b/ równanie kinetyczne - v = k·c1·c2· ...cn : określa zależność szybkości reakcji od
n c - stężeń substratów (krzywa kinetyczna reakcji)
n k - stałej szybkości reakcji - k = A·e-DE/R·T - zależność ta uwzględnia wpływ: T - temperatury (jej wzrost przyspiesza przebieg reakcji chemicznych) oraz DE - Eakt - energii aktywacji (konieczna do pokonania bariera energetyczna - m.in. zrywanie wiązań chemicznych - utrudniająca zajście każdej reakcji) - analiza profilu energetycznego reakcji - DG - efekt energetyczny reakcji (nie ma związku z szybkością reakcji), Eakt - energia stanu przejściowego, im jest ona niższa tym reakcja biegnie szybciej; rola katalizatora - przyspieszenie przebiegu reakcji przez obniżenie Eakt (w wyrażeniu na stałą szybkości reakcji zawiera się wyjaśnienie wpływu działania katalizatora, nie zmienia on stanu równowagi podyktowanego stałą równowagi reakcji ale przyspiesza jego osiągnięcie przez obniżenie energii aktywacji danego procesu)
ENZYMY jako (BIO)KATALIZATORY obniżają Eakt katalizowanej reakcji
3. Cechy charakteryzujące enzymy jako katalizatory:
a/ sprawność (wydajność) katalityczna - zdolność przyspieszania rzędu 106 - 1012 razy,
np. reakcja, która w obecności enzymu zwiększającego szybkość 108 razy biegnie 1s
w jego nieobecności musiałaby trwać 108s to znaczy TRZY LATA!!!
b/ swoistość - może być względem substratu, względem reakcji lub względem reakcji i
substratu; enzymy są znacznie bardziej selektywne niż jakiekolwiek inne katalizatory
c/ działanie w łagodnych warunkach - niskie ciśnienie, temperatura i zakres łagodnych
wartości pH (2 - 8, większość aktywna w pH około 7); katalizatory wykonane przez
człowieka wymagają często bardzo wysokich ciśnień, temperatur i stężeń H+ lub OH-
d/ aktywność może ulegać regulacji - istnieje szereg enzymów, które zmieniają
aktywność stosownie do aktualnych potrzeb komórki czy organizmu pod wpływem
czynników środowiskowych (zmiany jakościowe) lub zmienia się ilość enzymu
(zmiany ilościowe)
4. Enzymy - tworzenie kompleksu enzymu z substratem, ES: tak wielką sprawność, wydajność
katalityczną enzymy uzyskują dzięki tworzeniu przejściowego połączenia z substratem tzw.
kompleksu ES; pozwala to na pokonanie barier termodynamicznych i fizykochemicznych
utrudniających zajście reakcji a mianowicie:
a/ rozproszenia i ruchliwości cząsteczek substratów oraz znacznej przypadkowości
zderzeń w sensie kontaktu reaktywnych ugrupowań substratów (niska efektywność
zderzeń) - enzym „porządkuje” stan substratu(ów) pokonując te efekty entropowe
b/ uwodnienia substratu co w przypadku reakcji biegnących w środowisku wodnym jest
zjawiskiem powszechnym - enzym lokując substrat(y) w obszarze o charakterze
hydrofobowym pozbawia go(je) płaszcza wodnego odsłaniając na działanie swoich
aktywnych grup
c/ stabilności utrwalonej struktury substratu - enzym wytwarza w substracie napięcia,
naprężenia, odkształcenia co powoduje labilizację, osłabienie wiązań, które mają
ulec zerwaniu
5. Enzym wiąże się z substratem w kompleks ES w wyniku zaistnienia wielu odwracalnych, słabych oddziaływań rzędu ułamków do kilku kilokalorii wywołując efekt energetyczny, energię wiązania ES wielkości kilku do kilkunastu kilokalorii; część tej energii, uwalnianej w trakcie tworzenia ES wykorzystywana jest np. do wywołania naprężeń, napięć w substracie służąc w ten sposób m.in. zmniejszeniu energii aktywacji danej reakcji (obliczenie oparte na zależności podanej w punkcie 2b pozwala wykazać, ze obniżenie aktywacji o 15-20 kcal/mol zwiększa stałą szybkości reakcji (k) a tym samym szybkość reakcji (v) ~1014 razy!)
6. Enzym - centrum aktywne - kompleks ES tworzy się przez przyłączenie substratu do wyróżnionego miejsca w strukturze enzymu określanego jako miejsce aktywne, które charakteryzuje się następującymi własnościami:
a/ obejmuje niewielką część całkowitej objętości enzymu
b/ jest trójwymiarową strukturą, którą często tworzą bardzo odległe sekwencyjnie
aminokwasy (np. chymotrypsyna)
n istnieją centra aktywne jakby przygotowane na przyjęcie danego substratu - aprioryczne dopasowanie (np. lizozym, chymotrypsyna)
n centra aktywne innych enzymów tworzą się w trakcie wiązania substratu - indukowane dopasowanie (np. karboksypeptydaza A)
c/ stanowi zagłębienie w strukturze enzymu (niszę, szczelinę, kieszeń) dzięki czemu
otoczenie wiązanego substratu ma charakter hydrofobowy i jest mniej lub
bardziej izolowane od wody
d/ substrat wiązany jest poprzez wiele oddziaływań nie kowalencyjnych jak
hydrofobowe, jonowe, wodorowe czy van der Waalsa a swoistość wiązania substratu
uzależniona jest w efekcie od precyzyjnego ułożenia i dopasowania wielu atomów
centrum aktywnego i substratu
e/ w jego skład wchodzą:
n aminokwasy odpowiedzialne za związanie substratu, określające tym samym swoistość substratową (1-szy etap procesu katalizy) oraz
n aminokwasy uczestniczące w katalizie, tzw. centra katalityczne określające swoistość reakcji (2-gi etap procesu katalizy)
7. Kompleks enzym-substrat - dowody na istnienie:
a/ zmiany właściwości fizykochemicznych enzymu w tym m.in. rozpuszczalności czy
widma pochłaniania promieniowania elektromagnetycznego po związaniu substratu
b/ badania rentgenograficzne pozwalają czasami obserwować inne formy krystaliczne
samego enzymu i jego kompleksu z substratem lub analogiem substratu
c/ w przypadku dużych struktur można niekiedy oglądać połączenie enzymu z
substratem w mikroskopie elektronowym
d/ kinetyka reakcji enzymatycznych również potwierdza tworzenie się kompleksu ES
8. Kinetyka reakcji enzymatycznych:
a/ założenia Michaelisa - Menten (M-M):
n tworzenie się kompleksu enzym-substrat - E*S
n reakcja jednosubstratowa - E + S ↔ E*S ↔ E*P ↔ E + P
analiza przebiegu reakcji w początkowym (vo), bardzo krótkim przedziale czasu; tylko wówczas znamy stężenie substratu ([So]) i można pominąć wpływ bardzo niskiego stężenia produktu a powyższa reakcja upraszcza się do - k1à k2
E + S ↔ E*S → E + P
ßk-1
n stężenie molowe substratu wielokrotnie wyższe niż stężenie molowe enzymu, utrzymuje się tzw. stan stacjonarny - stałe stężenie kompleksu E*S przy zmieniających się stężeniach substratu (maleje) i produktu (wzrasta)
b/ analiza stanu stacjonarnego - stanu zrównoważonych szybkości tworzenia i rozpadu
E*S - prowadzi do zależności początkowej szybkości reakcji enzymatycznej (vo)
od początkowego stężenia substratu ([So]):
Vmax · [So]
vo = Km = k-1 + k2 / k+1 - stała M-M, Vmax - szybkość maksymalna
Km + [So] wykresem tej zależności vo od [So] jest krzywa hiperboliczna
c/ znaczenie poszczególnych parametrów kinetycznych reakcji enzymatycznej:
n Km - określa powinowactwo substratu do enzymu; stężenie substratu, przy
którym szybkość reakcji równa się 0.5·Vmax; jednostki stężenia [=] M;
najczęstsze wartości w zakresie stężeń mM-mM
n k2 º kkat - stała szybkości reakcji powstawania produktu, tzw. liczba obrotów - ilość moli produktu tworzonych w jednostce czasu (s) przez jeden mol enzymu; jednostki odwrotności czasu [=] s-1, wartości wahają się w granicach od rzędu 106 do mniejszych niż 1
n Vmax - maksymalna prędkość katalizowanej reakcji przy danym stężeniu enzymu - aktywność enzymu; jednostki stężenia/czas, najczęściej stosowane mM/s lub mM/s
n kkat /Km - najlepiej określa skuteczność enzymu, jego sprawność przy stężeniach substratu znacznie poniżej wartości Km (odpowiada to często warunkom fizjologicznym); dla najskuteczniejszych enzymów kkat /Km » k1 co oznacza, że wydajność katalizowanych przez nie reakcji jest ograniczona jedynie dyfuzją cząsteczek w roztworze i nie może przekroczyć wartości 108-109 M-1s-1
n wyznaczanie wartości Km i Vmax - stosowanie odwróconej postaci zależności M-M; wyrażenie Lineweavera-Burka - 1/vo = 1/Vmax + Km/Vmax · 1/[So] - wykres zależności 1/vo od 1/[So] to linia prosta z charakterystycznymi punktami przecięcia osi 1/[So] = -1/ Km a osi 1/vo = 1/Vmax
9. Wyznaczanie i sposoby wyrażania aktywności enzymów - konieczność znajomości i stosowania optymalnych warunków przebiegu reakcji katalizowanej przez dany enzym:
a/ Km - stosuje się wysycające stężenia substratów - [S] > Km
b/ niezbędne kofaktory - indywidualny dobór rodzaju i stężeń
c/ pH - indywidualna zależność
d/ temperatura (T) - zasadniczo jednakowa zależność dla większości enzymów z
maksimum aktywności dla około 40oC
e/ jednostki aktywności:
n jednostki międzynarodowe (IU, U): 1U to aktywność wytwarzająca 1mmol produktu/min
n katale: 1kat to aktywność wytwarzająca 1 mol produktu/s; 1katal=6·107 U, 1U=16.67 nKat
10. Kinetyka niehiperboliczna:
n wiele enzymów nie wykazuje hiperbolicznej zależności vo od [So], wykres ma najczęściej kształt sigmoidalny (przypomina krzywą wysycenia Hb tlenem) co generalnie sygnalizuje zjawisko allosterii z dodatnią kooperacją co najmniej dwóch centrów aktywnych - są to tzw. enzymy allosteryczne, zbudowane zasadniczo z wielu identycznych lub różnych podjednostek, które współpracują, kooperują ze sobą (patrz HEMOGLOBINA p. 8 i 9)
...
szylontko