ROLA KALPAIN W PROCESIE KRUSZENIA MIĘSA.pdf

YWNO . Nauka. Technologia. Jako , 2005, 1 (42), 5 - 17

MARZENA NOWAK

ROLA KALPAIN W PROCESIE KRUSZENIA MI SA

S t r e s z c z e n i e

Krucho mi sa oraz czynniki na ni wpływaj ce od dawna s przedmiotem bada . Istnieje kilka

teorii wyja niaj cych proces kruszenia mi sa. Za najbardziej prawdopodobn uznana została kalpainowa

teoria tenderyzacji. Kalpainy spełniaj podstawowe kryteria stawiane czynnikom wpływaj cym na proces

kruszenia mi sa. Enzymy te s obecne w komórce mi niowej, a w do wiadczeniach przeprowadzanych

in vitro prowadz do tych samych produktów degradacji białek, jakie wykrywane s w mi sie po okresie

dojrzewania. Maj one dost p do miofibryli w komórce. Aktywno kalpain oraz stosunek aktywno ci

kalpainy do aktywno ci kalpastatyny s skorelowane z twardo ci mi sa. Im wy sza jest aktywno

kalpain i im wy szy stosunek kalpaina/kalpastatyna, tym bardziej kruche mi so otrzymuje si . Warunki w

jakich enzymy te wykazuj aktywno s zbli one do warunków panuj cych w tkance mi niowej po

mierci zwierz cia. Na aktywno kalpain w mi sie działaj zarówno czynniki przy yciowe, w tym

genetyczne, jak i po miertne.

Mimo, e mechanizm działania kalpain nie jest całkowicie wyja niony, na podstawie wyników

licznych do wiadcze mo na stwierdzi , e kalpainy pełni wa n rol w procesie tenderyzacji mi sa.

W artykule scharakteryzowano kalpainy i opisano niektóre z czynników wpływaj cych na ich

aktywno .

Słowa kluczowe: kalpainy, kruszenie mi sa (tenderyzacja).

Wprowadzenie

Wi kszo konsumentów uwa a krucho za najwa niejsz cech jako ciow

mi sa. Jednak wyprodukowanie mi sa kruchego, o okre lonym standardzie, jest bardzo

trudne ze wzgl du na niewyja niony dot d mechanizm jego kruszenia [30]. Konieczne

jest wi c zrozumienie tego mechanizmu, aby mo na było sterowa procesem kruszenia

[29].

Istnieje du e zró nicowanie jako ci mi sa zarówno pomi dzy ró nymi gatunkami

zwierz t, jak i w obr bie tego samego gatunku. Jako mi sa jest zale na tak e od

warunków rodowiska i od płci zwierz cia [33].

Mgr in . M. Nowak, Katedra Przetwórstwa Produktów Zwierz cych, Akademia Rolnicza, Al. 29

Listopada 54, 31-425 Kraków

Marzena Nowak

W celu poprawy krucho ci konieczne jest przechowywanie mi sa post mortem

przez okres od kilkunastu godzin do kilku tygodni w temperaturze 3–5 o C. Taki okres

nazywany jest dojrzewaniem. Podczas dojrzewania zachodzi proces tenderyzacji, który

zale y od warunków chłodzenia, rodzaju mi nia oraz gatunku zwierz cia.

Prawdopodobnie ró nice te s spowodowane działalno ci kalpain w mi sie. Mog by

tak e wynikiem stopnia zesztywnienia mi nia po mierci zwierz cia, które przebiega

znacznie szybciej w mi sie drobiowym ni w wołowinie [43]. Czas dojrzewania

wołowiny wynosi 2–4 tygodni, wieprzowiny 6–10 dni, a drobiu 0,5–1 dnia [46, 55].

Teorie dotycz ce procesu kruszenia mi sa

Obecnie istniej dwie główne teorie dotycz ce procesu tenderyzacji mi sa. Jedn z

nich jest „wapniowa teoria tenderyzacji” proponowana przez Takahashiego [55]. Według

tej teorii jony wapnia bezpo rednio działaj ce na włókna mi niowe przyczyniaj si do

kruszenia mi sa podczas dojrzewania poubojowego. Osłabienie linii Z nast puje w

wyniku odł czania si fosfolipidów pod wpływem przył czaj cych si do nich jonów

wapnia. Rozpuszczalno fosfolipidów zmienia si pod wpływem tych jonów. Według

teorii Takahashiego [55] rozpad titiny zachodzi nawet wtedy, gdy w roztworze znajduj

si jednocze nie jony wapnia i inhibitory proteaz. Niezb dna ilo wapnia w komórce,

konieczna do spowodowania widocznych zmian w krucho ci mi sa, wynosi 0,1 mM.

Zmiany te nie s zale ne od pH mi nia, ani od temperatury [53]. Jednak wielu

naukowców twierdzi, e za proces kruszenia mi sa odpowiedzialny jest, zale ny od

st enia jonów wapnia, system kalpainowy [7, 29, 42]. Kalpainy uznano za jeden z

mo liwych czynników przyczyniaj cych si do kruszenia mi sa, poniewa : s

umieszczone w obr bie komórek tkanki mi niowej, maj dost p do substratu, maj

zdolno hydrolizowania białek degradowanych podczas dojrzewania mi sa post

mortem . Przeprowadzono wiele bada , które dowiodły, e kalpainowy system

proteolityczny jest odpowiedzialny za proces tenderyzacji. Niektóre z dowodów to:

przyspieszenie proteolizy post mortem po inkubacji kawałków mi nia w roztworze

jonów wapnia i zatrzymanie proteolizy po inkubacji z chelatorami jonów wapnia [28],

blokowanie proteolizy i tenderyzacji mi sa po wstrzykni ciu chlorku cynku,

potencjalnego inhibitora kalpain [58].

Do niedawna istniała teoria, e do tenderyzacji mog przyczynia si równie

katepsyny – proteolityczne enzymy lizosomalne. Powodem odrzucenia tej teorii jest fakt,

e maj one mo liwo rozkładu miozyny, aktyny i a-aktyniny [59], podczas gdy w

czasie normalnego dojrzewania mi sa niewielka ilo tych białek jest degradowana [42].

Ponadto, s one umieszczone w lizosomach i nie ma dowodu na to, e po mierci

zwierz cia nast puje ich uwolnienie [30]. Innym systemem funkcjonuj cym w komórce

jest multikatalityczny kompleks proteolityczny (MCP). Jednak kompleks ten działa na

białka, które nie s rozkładane podczas procesu dojrzewania. Dlatego te enzymów tego

kompleksu nie uznano za przyczyniaj cych si do tenderyzacji mi sa [30].

ROLA KALPAIN W PROCESIE KRUSZENIA MI SA

Charakterystyka kalpain

Kalpainy (E C 3.4.22.17) s wewn trzkomórkowymi, aktywowanymi przez jony

wapnia neutralnymi proteinazami i zaklasyfikowane zostały do grupy cysteinowych

endopeptydaz. Znajduj si one we wszystkich komórkach kr gowców; w mi niu

wyst puj w cytoplazmie [8]. Głównymi komponentami systemu kalpainowego s :

m-kalpaina, m-kalpaina, m/m kalpaina oraz ich specyficzny inhibitor kalpastatyna.

Kalpastatyna hamuje tylko aktywno kalpain, nie działa na inne proteazy cysteinowe.

Mo e ona wyst powa w kilku ró nych izoformach, które maj jedn , trzy lub cztery

domeny i ró ne N-terminalne sekwencje [15]. Jest to białko o masie cz steczkowej

60·10 3 -70·10 3 Da. Ma ona cztery miejsca inhibitorowe o powtarzaj cej si strukturze

130-aminokwasowej. Wi e si ona z kalpain w obecno ci jonów wapnia.

Kalpastatyna jest równie substratem kalpainy. Powstaj ce w wyniku hydrolizy

peptydy maj nadal zdolno hamowania aktywno ci kalpainy [22]. Istnieje tak e tzw.

kalpaina 3 (p94), która przez długi czas nie mogła by analizowana ze wzgl du na

szybk autoliz w warunkach in vitro , a tak e dlatego, e jest zwi zana z titin , która

prawdopodobnie reguluje jej aktywno [48]. Opinie dotycz ce roli kalpainy p94 w

procesie tenderyzacji nie s jednoznaczne. Parr i wsp. [40] nie zauwa yli wpływu

kalpainy p94 na krucho mi sa. Natomiast Illian i wsp. [21] stwierdzili wyra ny

zwi zek pomi dzy zawarto ci kalpainy 3 a wzgl dn szybko ci tenderyzacji.

Stwierdzili oni wa n rol m-kalpainy i kalpainy 3 w procesie tenderyzacji mi sa.

Odkryto tak e inne specyficzne kalpainy tkankowe (nCl-2, n-Cl-3, n-Cl-4...)

i nietypowe, jak: kalpainy 5, 6, 10. Prawdopodobnie istnieje jeszcze wiele innych

niewyizolowanych dotychczas kalpain [15, 35, 49, 51]. Nietypowe kalpainy odkryto

głównie w takich organizmach, jak: insekty, dro d e, grzyby. Ich nietypowo polega

na tym, e maj one domen o masie około 30·10 3 Da, podobn bardziej do du ej

podjednostki kalpain ssaków ni do proteinaz, takich jak papaina czy katepsyny,

a pozostałe domeny s prawdopodobnie odpowiedzialne za specyficzne funkcje, jakie

mog spełnia [49]. Najnowszym odkryciem jest kalpaina C, która została

wyodr bniona podczas bada Drosophila melanogaster i która prawdopodobnie jest

nieaktywna katalitycznie [50].

Najbardziej znanymi i najcz ciej badanymi s m- i m-kalpaina. Nazwy m- i m-

kalpainy pochodz od st enia jonów wapnia wymaganego do ich aktywacji; m-

kalpaina wymaga 3–50 mM, a m-kalpaina 0,4–0,8 mM wapnia do osi gni cia połowy

aktywno ci maksymalnej. St enie jonów wapnia w ywym mi niu wynosi 0,2 mM

[32] i jest to poziom du o ni szy ni ten wymagany do aktywacji m-kalpain. Jednak po

uboju st enie wolnego wapnia w komórce zwi ksza si i wynosi 100 mM [24]. W celu

zapocz tkowania procesu autolizy in vitro (czyli do uaktywnienia) konieczne jest

st enie jonów wapnia wynosz ce 100 mM, ale poziom ten zmniejsza obecno

fosfolipidów lub membran plazmowych [6]. Hopkins i Thompson [17] wykazali, e

Marzena Nowak

st enie jonów wapnia po uboju, w momencie osi gni cia pH 5,5, w owczych

mi niach m. longissimus lumborum i m. longissimus thoracis wynosiło 110 mM, co

jest warto ci wystarczaj c do aktywacji m-kalpainy.

Obie kalpainy (m- i m-kalpaina) zostały oczyszczone i wyodr bnione z wielu

ródeł, chocia adna nie została wykrystalizowana. S to heterodimery składaj ce si

z du ej podjednostki (80·10 3 Da, jednostka regulacyjna) i małej podjednostki

(30·10 3 Da). Du a podjednostka m-kalpainy jest w 50% homologiczna z du

podjednostk m-kalpainy, natomiast małe podjednostki s identyczne u obu kalpain [8,

27]. Podjednostka - i m-kalpainy o wielko ci 80·10 3 Da mo e by podzielona na

cztery domeny. Domena I jest krótkim fragmentem wprowadzaj cym i działa jako

inhibitor aktywno ci proteolitycznej. Domena II reprezentuje odległ , podobn do

papainy cz typow dla proteinaz cysteinowych. Domena III nie jest homologiczna z

adnym innym białkiem. Analiza strukturalna wskazuje, e domena III fizycznie

asocjuje si z domen II. Domena IV wi e jony wapnia i została wyodr bniona jako

rozpoznaj ca substrat, ma ona charakterystyczny motyw strukturalny, powtórzony

czterokrotnie a nazywany „EF-hands”. Pary motywów strukturalnych „EF-hands”

tworz globularne domeny, które maj wspólny hydrofobowy rdze , a które s

poł czone długim odcinkiem a-helikalnym. Mała podjednostka składa si z domen V

i VI. Domena V zawiera du liczb reszt glicynowych i reszt aminokwasów

hydrofobowych. Domena VI jest homologiczna z domen IV, ma cztery rejony

wi ce jony Ca 2+ . Obie podjednostki poł czone s wi zaniem niekowalencyjnym [2,

3, 23].

Mechanizmy aktywacji kalpain

Aktywacja przez jony wapnia, przył czaj ce si do ko ca ka dej podjednostki,

powoduje hydroliz obu cz ci (du a podjednostka zmniejsza swoj mas do 76·10 3

Da, natomiast mniejsza do 18·10 3 Da) i w rezultacie powstaje aktywny enzym [8].

Koohmaraie [27] wykazał, e w wyniku autolizy małej podjednostki powstaje

przewa nie jeden główny fragment 18·10 3 Da, chocia mo liwe, e powstaje seria

produktów o masie cz steczkowej od 30·10 3 do 18·10 3 Da, a takie fragmenty nie mogły

by wychwycone przez el SDS-PAGE u yty w do wiadczeniu. Natomiast du a

podjednostka rozpada si na kilka ró nych fragmentów o masie cz steczkowej od

61·10 3 do 21·10 3 Da. Polipeptyd o masie cz steczkowej 40·10 3 Da reprezentuje ju

nieaktywn form kalpainy.

Yoshizawa i wsp. [61] zaproponowali nieco inny mechanizm aktywacji. Pod

wpływem jonów wapnia kalpaina rozpada si na dwie odr bne podjednostki. Jednostka

80·10 3 Da nie ró ni si wła ciwo ciami katalitycznymi od całej kalpainy,

charakteryzuje si natomiast wi ksz wra liwo ci na jony wapnia. Odł czona

podjednostka 80·10 3 Da wymaga st enia wapnia takiego samego jak zautolizowana

aktywna forma kalpainy.

ROLA KALPAIN W PROCESIE KRUSZENIA MI SA

Aktywno m-kalpainy zmniejsza si gwałtownie w ci gu pierwszych dni po

uboju (po 72 godz. jej aktywno była mniejsza ni czuło zastosowanej metody

analitycznej), podobnie dzieje si z aktywno ci kalpastatyny, natomiast aktywno m-

kalpainy jest stabilna [27]. Spadek aktywno ci -kalpainy koreluje z podwy szeniem

stopnia krucho ci [56]. Optymalne warunki aktywno ci kalpain ustalone in vitro to

temp. 25 o C i pH w zakresie od 7,2–8,2 [8]. Jednak podczas dojrzewania mi so

przechowywane jest w temp. poni ej 15 o C, a jego pH wynosi około 5,5. W badaniach

przeprowadzonych przez Kanaw i wsp. [25] m-kalpaina wykazała maksimum swojej

aktywno ci przy pH 7,58 i w temp. 25 o C, była ci gle aktywna przy pH 5,5 w tej samej

temperaturze, wykazuj c 17,7% swojej aktywno ci maksymalnej, ale w warunkach pH

5,78 i w temp. 5 o C była całkowicie nieaktywna. Z bada Koohmaraie’go [27] wynika

jednak, e stopie inaktywacji proteolitycznej m-kalpainy zwi ksza si ze

zmniejszaj cym si pH i ze wzrostem temperatury. Po 60 min, w temp. 25 o C i przy pH

5,8 m-kalpaina zachowała jedynie 9,2% swojej aktywno ci pocz tkowej, a po 120 min,

w temp. 5 o C zachowała 79,2% swojej pocz tkowej aktywno ci. Badania Huff-

Lonergan i wsp. [18] potwierdziły, e oczyszczone miofibryle s degradowane przez

m-kalpain w temp. 4 o C przy pH równym 5,6 z dodatkiem 100 mM chlorku wapnia.

Wiele bada wskazuje na to, e aden inny czynnik, jak tylko kalpainy pełni główn

rol w procesie kruszenia mi sa [1, 28, 31, 41].

Du a cz kalpain jest zwi zana z miofibrylami. Aktywno kalpain zwi zan

z miofibrylami przypisuje si głównie m-kalpainie. Zwi zany w ten sposób enzym ma

lepszy dost p do substratu i jest bardziej oporny na inhibicj przez kalpastatyn [1].

Jednak analiza mi ni pochodz cych z owiec z fenotypem callipyge oraz ze zwierz t

normalnych wykazała, e aktywno zwi zanej z miofibrylami kalpainy jest taka sama,

podczas gdy twardo mi sa jest dwa razy wi ksza u owiec callipyge. W zwi zku z

tym wydaje si niemo liwe, aby zwi zana z miofibrylami kalpaina miała du y udział w

procesie tenderyzacji [5].

Funkcje kalpain

Funkcje kalpain nie zostały dot d w pełni okre lone. Wiadomo, e s zwi zane

z podstawowymi frakcjami komórkowymi. Potwierdzono, e kalpaina-10 powoduje

zaburzenia w wydzielaniu i działaniu insuliny w ywym organizmie [51]. Istniej

dowody na to, e kalpainy przyczyniaj si do remodelowania cytoszkieletu aktyny,

migracji komórki oraz transformacji onkologicznych [2]. Wi kszo składników

włókien mi niowych, szczególnie białek cytoszkieletowych, uznano za potencjalny

substrat biologiczny kalpain [46]. Teoretycznie aktywno m-kalpainy in situ powoduje

proteolityczny rozpad, który z kolei osłabia struktur włókien mi niowych, daj c w

rezultacie kruche mi so po ugotowaniu. Aby rozpocz ł si proces kruszenia musi

nast pi wzrost st enia wolnych jonów wapnia w cytoplazmie, jony wapnia powoduj

wtedy aktywacj kalpain, które nast pnie hydrolizuj białka buduj ce struktur włókna

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: