13_Wlasnosci_i_sklad_kwasow_nukleinowych.pdf

13.

WŁASNO Ś CI I SKŁAD

KWASÓW

NUKLEINOWYCH

1. Preparatyka kwasów nukleinowych z dro Ŝ d Ŝ y

Zasada:

W komórce – zarówno w j ą drze, jak i w cytoplazmie – wi ę kszo ść kwasów nu-

kleinowych wyst ę puje w formie nukleoprotein. Izolowanie takich poł ą cze ń wy-

maga zastosowania łagodnej procedury ekstrakcyjnej, poniewa Ŝ pod wpływem

st ęŜ onych soli nukleoproteiny dysocjuj ą na kwas nukleinowy i białka. Opisana

poni Ŝ ej preparatyka kwasów nukleinowych z dro Ŝ d Ŝ y polega na rozbiciu komó-

rek oraz usuni ę ciu białek z ekstraktu za pomoc ą anionowego detergentu siar-

czanu dodecylu sodu (SDS), który jednocze ś nie hamuje aktywno ść rybonukleaz

(dzi ę ki denaturacji białek). Kwasy nukleinowe wytr ą ca si ę z ekstraktu za pomo-

c ą etanolu. W komórkach dro Ŝ d Ŝ y wi ę kszo ść kwasów nukleinowych stanowi ą

kwasy rybonukleinowe, natomiast DNA nie osi ą ga 2% całkowitej zawarto ś ci

kwasów nukleinowych. Zastosowana metoda ekstrakcji kwasów nukleinowych

z tego materiału biologicznego (dro Ŝ d Ŝ y) pozwala otrzyma ć preparaty, które

przede wszystkim zawieraj ą RNA o wysokiej masie cz ą steczkowej. Preparaty te

charakteryzuj ą si ę nisk ą zawarto ś ci ą DNA (około 0,5%) oraz stosunkowo ni-

skim stopniem zanieczyszczenia białkami (do 2% preparatu).

Wykonanie:

W zlewce ogrza ć do wrzenia 55 ml 6% roztworu SDS na płytce elektrycznej,

stale mieszaj ą c. Doda ć 25 g rozdrobnionych dro Ŝ d Ŝ y piekarskich i dalej

ogrzewa ć przez 1 minut ę . Przenie ść zlewk ę z ekstraktem z płytki elektrycznej

do wrz ą cej ła ź ni wodnej i ogrzewa ć nast ę pne 2 minuty, stale mieszaj ą c. Eks-

trakt schłodzi ć do temperatury 4 0 C, po czym wirowa ć przy 3000 obr./min

przez 10 minut w wirówce laboratoryjnej.

Supernatant (płyn znad osadu) zla ć do cylindra miarowego, zmierzy ć obj ę -

to ść , po czym wla ć do dwóch obj ę to ś ci ozi ę bionego w lodzie 95% etanolu.

Po upływie 5 minut odwirowa ć osad wytr ą conego kwasu nukleinowego,

w warunkach opisanych powy Ŝ ej. Osad rozpu ś ci ć w 10 ml 0,1 M NaOH.

Roztwór nukleinianu zachowa ć do nast ę pnych ć wicze ń .

2. Rozpuszczalno ść kwasów nukleinowych

Zasada:

Kwasy nukleinowe maj ą charakter polianionowy, wynikaj ą cy z bogactwa reszt

fosforanowych w ich strukturze, dzi ę ki którym maj ą odczyn kwasowy. Dlatego

wolne kwasy nukleinowe dobrze rozpuszczaj ą si ę w roztworach zasadowych,

natomiast słabo w rozcie ń czonych kwasach i w wodzie. Kwasy nukleinowe

w wodnych roztworach tworz ą koloidy, z których łatwo mo Ŝ na je wytr ą ci ć od-

czynnikami odwadniaj ą cymi, np. etanolem, który jest powszechnie wykorzy-

stywany w metodach izolacyjnych do oczyszczania kwasów nukleinowych.

Wykonanie:

Do 0,5 ml roztworu 0,1% nukleinianu dodawa ć kroplami 0,1 M HCl a Ŝ do

wytr ą cenia osadu kwasu nukleinowego. Nast ę pnie doda ć kroplami 1 M

NaOH, a Ŝ do ponownego rozpuszczenia osadu.

Do 0,5 ml roztworu nukleinianu doda ć 1 ml 95% etanolu. Zaobserwowa ć

wytr ą canie si ę osadu kwasu nukleinowego.

3. Hydroliza kwasowa RNA

Zasada:

Wykrywanie obecno ś ci kwasów nukleinowych w materiale biologicznym opie-

ra si ę na ich wielkocz ą steczkowym charakterze, charakterystycznych własno-

ś ciach absorbowania ś wiatła UV oraz na analizie jako ś ciowej składu kwasów

nukleinowych. Wi ę kszo ść charakterystycznych reakcji dla poszczególnych

składników kwasów nukleinowych, zachodzi dopiero po hydrolizie makrocz ą -

steczki na składniki proste. W tym celu nale Ŝ y przeprowadzi ć hydroliz ę che-

miczn ą kwasu nukleinowego. DNA jest odporne na działanie mocnych zasad,

pozostawiony w roztworze 1M NaOH przez 20–40 godz. w temp. 37 0 C nie do-

starcza Ŝ adnych produktów hydrolizy zasadowej. W tych warunkach RNA roz-

pada si ę całkowicie do mieszaniny 2 ’ - i 3 ’ -monofosfonukleozydów. Mo Ŝ liwe

jest to dzi ę ki obecno ś ci grupy –OH przy atomie C2 ' rybozy, która w ś rodowisku

zasadowym uczestniczy w tworzeniu nietrwałych cyklicznych nukleozydo-2 ’ ,3 ’ -

-fosforanów, rozpadaj ą cych si ę z równym prawdopodobie ń stwem do nukleozy-

do-2 ’ - i nukleozydo-3 ’ -fosforanów. Brak grupy –OH przy atomie C2 ' deoksyry-

bozy uniemo Ŝ liwia powstanie cyklicznych fosforanów nukleozydów podczas

hydrolizy zasadowej DNA i jest to przyczyn ą oporno ś ci kwasów deoksyrybo-

nukleinowych na działanie zasad, dlatego DNA hydrolizuje si ę w ś rodowisku

kwasowym. Hydroliza kwasowa kwasów nukleinowych dostarcza ró Ŝ nych pro-

duktów zale Ŝ nie od st ęŜ enia stosowanych kwasów, czasu trwania hydrolizy

i temperatury. Wi ą zania glikozydowe ró Ŝ ni ą si ę wra Ŝ liwo ś ci ą na działanie kwa-

sów, tzn. w nukleotydach purynowych wi ą zania glikozydowe s ą bardziej la-

bilne ni Ŝ w nukleotydach pirymidynowych. Dlatego krótkotrwałe ogrzewanie

(w 100 0 C), zarówno DNA, jak i RNA z kwasami (np. HCl) o małych st ęŜ eniach

(ok. 1 M) dostarcza pocz ą tkowo kwasów apurynowych, które s ą ła ń cuchami

polinukleotydowymi, pozbawionymi zasad purynowych, a dopiero w dalszym

etapie hydrolizy (po 1 godz.) dostarcza mononukleotydów pirymidynowych,

pentoz i kwasu fosforowego. Natomiast pod działaniem mocnych kwasów mi-

neralnych (np. 72% roztwór HClO 4 ) i w podwy Ŝ szonej temperaturze (100 0 C

przez 1 godz.) z obu typów kwasów nukleinowych nast ę puje uwolnienie zasad

purynowych i pirymidynowych, pentoz i kwasu fosforowego.

Wykonanie:

Do probówki odmierzy ć 5 ml nukleinianu z dro Ŝ d Ŝ y, doda ć 10 ml 10% H 2 SO 4

i ogrzewa ć we wrz ą cej ła ź ni wodnej przez 45 minut. Otrzymany hydrolizat

zachowa ć do nast ę pnych ć wicze ń .

3.1. Wykazanie obecno ś ci puryn

Zasada:

Zasady azotowe reaguj ą z jonami Ag + (lub Cu + ), tworz ą c nierozpuszczalne sole

kompleksowe.

Wykonanie:

Do 1 ml hydrolizatu nukleinianu doda ć st ęŜ onego amoniaku do odczynu lekko

alkalicznego, ocenionego papierkiem wska ź nikowym. Roztwór przes ą czy ć ,

je ś li nie jest klarowny. Do klarownego przes ą czu doda ć 0,3 ml 1% roztworu

AgNO 3 . Wytr ą ca si ę osad soli srebrowych puryn nierozpuszczalnych w amo-

niaku.

3.2. Wykazanie obecno ś ci kwasu fosforowego

Zasada:

Kwas fosforowy reaguje z molibdenianem amonu w obecno ś ci HNO 3 , w wy-

niku czego powstaje nierozpuszczalny fosfomolibdenian amonu, Ŝ ółto zabar-

wiony osad.

Wykonanie:

Do 0,5 ml hydrolizatu nukleinianu doda ć st ęŜ onego amoniaku do odczynu

oboj ę tnego, ocenionego papierkiem wska ź nikowym. Nast ę pnie doda ć 0,5 ml

st ęŜ onego HNO 3 , po czym 2 ml 5% roztworu molibdenianu amonu. Probów-

k ę z prób ą wstawi ć do wrz ą cej ła ź ni wodnej i ogrza ć do wrzenia. Podczas

ogrzewania pojawia si ę Ŝ ółty fosfomolibdenian amonu, co jest dowodem, Ŝ e

w hydrolizacie był kwas fosforowy.

4. Odró Ŝ nianie DNA od RNA

Nukleotydy buduj ą ce DNA zawieraj ą 2 ’ -deoksy-D-ryboz ę , a RNA D-ryboz ę .

Istnienie ró Ŝ nych pentoz jest podstaw ą chemicznego odró Ŝ niania preparatu

DNA od RNA.

4.1. Wykrywanie DNA metod ą Dischego

Zasada:

W ś rodowisku kwa ś nym (st ęŜ onego H 2 SO 4 i CH 3 COOH) deoksyryboza (wolna

i zwi ą zana w nukleotydach purynowych) tworzy z difenyloamin ą produkt kon-

densacji o barwie niebieskiej. Ta barwna reakcja jest konsekwencj ą powstania

aldehydu hydroksylewulinowego z deoksyrybozy pod wpływem działania kwa-

su siarkowego i octowego.

H O C H 2

O H

d e o ks yryb o za

O H

C H 3 C O O H

H 2 S O 4

C H 2

k o m p le ks b a rw y

n ie b ie s kie j

C H 2

C O

d ife n ylo am in a

C H 2 O H

a ld e h yd

h yd ro ks yle w u lin o w y

ω -

Nast ę pnie aldehyd ten kondensuje z difenyloamin ą , tworz ą c produkt o barwie

niebieskiej, którego maksimum absorpcji przypada przy długo ś ci fali 600 nm.

Oprócz deoksyrybozy reakcj ę t ę daje tak Ŝ e kwas N-acetyloneuraminowy. Po-

wstały produkt w ś rodowisku oboj ę tnym lub zasadowym ma barw ę Ŝ ółt ą . De-

oksyryboza zwi ą zana z zasadami pirymidynowymi i ryboza nie daj ą tego od-

czynu.

Wykonanie:

Przygotowa ć w statywie 4 probówki. Do ka Ŝ dej z nich odmierzy ć po 0,5 ml

roztworów, odpowiednio: kwasu nukleinowego nr 1 do pierwszej, kwasu nu-

kleinowego nr 2 do drugiej, deoksyrybozy do trzeciej i wody destylowanej do

czwartej (próba ś lepa).

Do wszystkich probówek wprowadzi ć po 1 ml odczynnika Dischego (1% di-

fenyloamina w H 2 SO 4 i CH 3 COOH lodowaty) i wymiesza ć .

· Probówki z analizowanymi próbami wstawi ć do wrz ą cej ła ź ni wodnej i ogrze-

wa ć przez 10 minut.

Zinterpretowa ć uzyskane wyniki, wyja ś ni ć , która próba kwasu nukleinowego

jest roztworem DNA.

4.2. Wykrywanie RNA metod ą orcynow ą

Zasada:

Wolne pentozy, fosfopentozy, jak te Ŝ zwi ą zane w nukleotydach purynowych

(lecz nie pirymidynowych) w kwasach nukleinowych podczas ogrzewania ze

st ęŜ onym HCl przechodz ą w furfural.

CHO

+ 2

furfural

CH 3

H 2 O

CH 3

orcyna

barwny kompleks

Powstały furfural tworzy z orcyn ą , w obecno ś ci katalitycznie działaj ą cych jo-

nów Fe +3 , kompleks o trwałej barwie zielonej, którego maksimum absorpcji

przypada przy długo ś ci fali 610 nm. W tych warunkach deoksyryboza reaguje

10-krotnie słabiej od rybozy, dlatego odczyn ten dla DNA wypada ujemnie. Re-

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: