Przygotowanie materiału do mikroskopu świetlnego.doc

3. PRZYGOTOWANIE MATERIAŁU DO BADAŃ W MIKROSKOPIE ŚWIETLNYM

Każdy preparat mikroskopowy musi spełniać trzy podstawowe warunki:

· musi być przejrzysty (oglądany jest w świetle przechodzącym), czyli odpowiednio cienki. Grubość preparatu nadającego się do rutynowego mikroskopowania nie powinna przekraczać 20 mm, a najlepszą jakość obrazu mikroskopowego uzyskuje się przy preparatach możliwie najcieńszych;

· powinien być odpowiednio skontrastowany (zabarwiony) w celu zróżnicowania występujących w nim struktur;

· struktura komórek i tkanek w preparacie winna być jak najbardziej zbliżona do struktury tkanki żywej, gdyż tylko wówczas uzyskane z obrazu mikroskopowego informacje mogą być wiarygodne.

Przygotowanie materiału biologicznego do badań mikroskopowych, będące niekiedy długą i skomplikowaną procedurą, podporządkowane jest właśnie tym warunkom.

3.1. Rodzaje preparatów mikroskopowych

Do preparatów mikroskopowych sporządzanych z materiałów biologicznych należą:

· skrawki: uzyskane przez pokrojenie materiału na cienkie "plasterki";

· szlify: uzyskane przez zeszlifowanie tkanek twardych (zmineralizowanych) na bardzo cienkie płytki;

· rozmazy: wykonywane z płynów ustrojowych, w których obecne są wolno zawieszone komórki (krew, punktat szpiku krwiotwórczego, płyn mózgowo-rdzeniowy, płyny wysiękowe), a także z zawiesin komórkowych uzyskanych w badaniach biochemicznych. Kroplę takiego płynu rozprowadza się na szkiełku podstawowym w taki sposób, aby zawarte w nim komórki utworzyły pojedynczą warstwę. W diagnostyce histopatologicznej wykonuje się rozmazy z materiału pobranego ze śluzówek (jama ustna, nosowo-gardłowa, pochwa) oraz z wydzielin (wydzielina oskrzelowa);

· rozgnioty: uzyskiwane poprzez zgniecenie komórek pomiędzy szkiełkiem podstawowym a nakrywkowym (stosowane jedynie do szczególnych badań, np. analizy chromosomów);

· odciski narządowe: wykonywane poprzez przekrojenie narządów lub ich fragmentów i odciśnięcie powierzchni przekroju na szkiełku podstawowym. Do szkiełka przywierają komórki luźno związane ze swym otoczeniem;

· preparaty całościowe (ang. whole mounts): położone na szkiełko całe fragmenty tkanek lub narządów - zazwyczaj są to wypreparowane warstwy ścian wewnętrznych przewodów (np. warstwa mięśniowa cewy pokarmowej), w których bada się przestrzenny układ włókien nerwowych lub sieci naczyniowych. Taki preparat musi być wystarczająco cienki, aby mogło przezeń przechodzić światło;

· hodowle komórkowe: hodowane w odpowiednich warunkach komórki mogą osadzać się na podłożu (np. szkiełku mikroskopowym), gdzie się namnażają tworząc pojedynczą warstwę (ang. monolayer). W tej postaci mogą być oglądane pod mikroskopem.

W praktyce najczęściej używane są skrawki i rozmazy.

3.2. Pobieranie materiału

Przy pobieraniu materiału należy zwrócić uwagę na dwie zasadnicze sprawy:

· fragment pobranej tkanki powienien być stosunkowo niewielki (do celów mikroskopii świetlnej przynajmniej jeden wymiar nie powinien przekraczać 5 mm, a do celów mikroskopii elektronowej 1 mm), aby zapewnić dobrą i możliwie szybką penetrację płynów stosowanych w dalszych etapach procedury (utrwalacz, płyny odwadniające i pośrednie); przy pobraniu większego fragmentu należy go przed utrwaleniem pokroić na mniejsze kawałki;

· jeżeli materiał pochodzi od uprzednio zabitego zwierzęcia laboratoryjnego, pobranie materiału powinno się odbyć za życia lub natychmiast po śmierci zwierzęcia, aby zapobiec zmianom rozkładowym w tkankach. Z tego samego powodu, jeżeli po pobraniu materiału trzeba go gdzieś przetransportować, należy użyć do tego celu pojemnika z lodem.

3.3. Utrwalanie

Procedura ta, jak sugeruje jej nazwa, ma "utrwalić" strukturę badanego materiału w jego pierwotnej postaci i nie dopuścić do zmian, które mogłyby tę strukturę zniekształcić.

3.3.1. Cele utrwalania

Utrwalanie materiału ma na celu:

· natychmiastowe zatrzymanie procesów metabolicznych w komórkach i tkankach, przede wszystkim poprzez denaturację enzymów. Można w ten sposób zapobiec zmianom autolitycznym, czyli samostrawieniu komórek przez ich własne enzymy lizosomowe, oraz wtórnym zmianom rozkładowym i gnilnym wywołanym przez obecne w materiale lub zawleczone z zewnątrz bakterie;

· związanie i wytrącenie (precypitację) niektórych zawartych w tkankach substancji rozpuszczalnych, co zapobiega ich późniejszej dyfuzji i umożliwia uwidocznienie;

· wstępne utwardzenie materiału i zwiększenie jego odporności na działanie odczynników używanych w dalszych etapach procedury;

· niekiedy również poprawę optycznego zróżnicowania tkanki poprzez wywołanie w niej reakcji chemicznych ułatwiających późniejsze barwienie.

Niewątpliwie najistotniejsze znaczenie mają trzy pierwsze cele utrwalania i prawie wszystkie utrwalacze spełniają zawarte w pierwszych trzech punktach warunki. Umożliwiają one zachowanie w utrwalonym materiale struktury możliwie najbardziej zbliżonej do naturalnej struktury żywych komórek i tkanek.

3.3.2. Rodzaje utrwalaczy

Utrwalanie możemy podzielić na chemiczne i fizyczne. Do utrwalaczy chemicznych należą (w nawiasach podano najczęściej stosowane stężenia):

· aldehydy: formaldehyd (aldehyd mrówkowy, formalina - 2‑10%), aldehyd glutarowy (1,5‑6,0%), akroleina (10%);

· alkohole: etylowy i metylowy (50‑100%);

· ketony: aceton (50‑100%);

· kwasy organiczne i nieorganiczne: kwas octowy (50‑100%), kwas pikrynowy (1%), kwas chromowy (2%), kwas taninowy (1%);

· związki metali ciężkich: chlorek rtęci (sublimat - 5‑7%), dwuchromian potasu (2,5‑5,0%), czterotlenek osmu (0,5‑2,0%)

Utrwalacze chemiczne podzielić można na proste, czyli jednoskładnikowe oraz złożone, będące mieszaniną dwóch lub kilku utrwalaczy prostych oraz niekiedy innych substancji. Do najczęściej stosowanych utrwalaczy złożonych należą np.: utrwalacz Bouina (kwas pikrynowy i formalina), utrwalacz Carnoya (alkohol etylowy, chloroform i kwas octowy), i utrwalacz Zenkera (sublimat, dwuchromian potasu, kwas octowy, siarczan sodu).

Rozpuszczalnikiem w roztworach utrwalaczy może być woda, bufory o określonym pH i sile jonowej, a w niektórych przypadkach również alkohole.

Utrwalanie fizyczne polega na oddziaływaniu na materiał mikrofalami lub promieniowaniem jonizującym.

3.3.3. Metody utrwalania

A. Utrwalanie immersyjne polega na zanurzeniu fragmentu tkanki w utrwalaczu na pewien okres (od 1 godz. do kilku dni). Jest to najprostszy sposób utrwalania, posiadający jednak dość istotną wadę. Utrwalacz przenika bowiem do tkanki z zewnątrz z określoną szybkością, zależną od jego rodzaju: najszybciej penetrują utrwalacze bezwodne, np. alkohol czy aceton, a najwolniej związki metali ciężkich. W związku z tym, przy większych fragmentach utrwalonej w ten sposób tkanki, uwidaczniają się w niej strefy różniące się stopniem zachowania struktury. Strefa obwodowa, do której utrwalacz przenika najszybciej, zostaje utrwalona prawie natychmiast i w pełni. Do strefy pośredniej utrwalacz dociera z pewnym opóźnieniem, co może sprzyjać powstawaniu artefaktów[1] związanych z procesami autolitycznymi. Wreszcie strefa centralna, do której utrwalacz przenika najpóźniej, jest najbardziej podatna na procesy destrukcji i jej struktura może w znacznym stopniu odbiegać od stanu naturalnego. Właśnie dlatego przy tej metodzie utrwalania istotne są małe rozmiary utrwalanego fragmentu tkanki.

B. Utrwalanie perfuzyjne polega na wypreparowaniu całego narządu lub jego głównych naczyń krwionośnych. Następnie do tętnicy doprowadzającej krew podłącza się kaniulę, przez którą tłoczona jest najpierw sól fizjologiczna, aby wypłukać krew z łożyska naczyniowego, a potem utrwalacz pod ciśnieniem zbliżonym do fizjologicznego. Przy równoczesnym otwarciu głównego naczynia żylnego stwarza się w ten sposób sztuczne krążenie - z tym, że zamiast krwi przepływa przez łożysko naczyniowe utrwalacz. Biorąc pod uwagę znaczną gęstość sieci naczyniowej (zwłaszcza naczyń włosowatych) w każdym narządzie, jest rzeczą oczywistą, że w tych warunkach utrwalacz dociera natychmiast do każdego rejonu narządu i przenikając przez ściany naczyń krwionośnych utrwala tkankę w sposób równomierny i bardzo szybko. Co za tym idzie, czas utrwalania perfuzyjnego może być krótki (5‑15 min). Ta metoda utrwalania zapewnia najdoskonalsze zachowanie struktury komórek i tkanek i dlatego jest szeroko stosowana zwłaszcza w mikroskopii elektronowej.

C. Utrwalanie przy użyciu mikrofal zyskało sobie w ostatnich latach znaczną popularność z uwagi na prostotę i krótkotrwałość procedury oraz na bardzo dobre zachowanie struktury materiału. Mikrofale są falami elektromagnetycznymi o długości od 0,3 mm do 30 cm, a zatem stanowią odcinek widma elektromagnetycznego pomiędzy promieniowaniem podczerwonym a falami radiowymi.

Procedurę utrwalania przeprowadza się w komercyjnie dostępnych kuchenkach mikrofalowych, lub specjalnie do tego celu skonstruowanych urządzeniach. Najczęściej stosuje się mikrofale o długości 12,2 cm (2450 MHz) lub 32,7 cm (915 MHz), doprowadzając tkankę do temperatury 45-55°C. Ekspozycja materiału na działanie mikrofal jest bardzo krótka - od kilku sekund do jednej minuty. Materiał musi być zanurzony w niewielkiej ilości (1-5 ml) roztworu soli fizjologicznej, buforu lub utrwalacza chemicznego, w plastikowym lub szklanym (nie metalowym!) pojemniku.

Istnieją cztery podstawowe sposoby utrwalania przy użyciu mikrofal:

· utrwalenie materiału znajdującego się w chemicznie obojętnym roztworze (czynnikiem utrwalającym są wyłącznie mikrofale);

· utrwalenie materiału zanurzonego w utrwalaczu chemicznym;

· wstępne utrwalenie chemiczne, a następnie ekspozycja na mikrofale;

· wstępna ekspozycja na mikrofale, a następnie utrwalenie chemiczne.

Najdoskonalsze zachowanie struktury (również na poziomie mikroskopu elektronowego) daje drugi z podanych sposobów.

3.3.4. Chemiczne podstawy procesu utrwalania

Każdy utrwalacz posiada grupy chemicznie aktywne, które wiążą się z określonymi grupami chemicznymi substancji obecnych w komórkach i tkankach. Prowadzi to do istotnych zmian chemicznych w utrwalanym materiale. Większość utrwalaczy aldehydowych i związków metali powoduje powstanie tzw. wiązań krzyżowych pomiędzy różnymi grupami chemicznymi struktur komórkowych i tkankowych, czego wynikiem jest ich dodatkowe usieciowanie - usztywnienie i wzmocnienie strukturalne, a także zablokowanie aktywnych centrów enzymów. Przykładowo: aldehydy tworzą wiązania krzyżowe pomiędzy końcowymi grupami polipeptydów i białek oraz mostki metylenowe (formaldehyd); sole chromu tworzą mostki typu -Cr-O-Cr- pomiędzy grupami karboksylowymi i hydroksylowymi, sole rtęci wiążą się z grupami -SH białek i z nukleotydami, a sole osmu przyłączają się do cząsteczek nienasyconych lipidów ulegając redukcji i powodując ich "usztywnienie". Duża grupa utrwalaczy, w tym alkohole i większość kwasów, to tzw. utrwalacze precypitujące, powodujące denaturację i wytrącania się białek bez tworzenia wiązań krzyżowych.

Dla możliwie pełnego zachowania struktury utrwalanej tkanki najkorzystniejsze są utrwalacze wytwarzające największą liczbę wiązań krzyżowych. Pod tym względem najbardziej efektywny jest aldehyd glutarowy - jest on utrwalaczem z wyboru w przygotowaniu materiału do rutynowej mikroskopii elektronowej.

3.3.5. Oddziaływanie mikrofal na tkankę

Działając na materiał biologiczny, mikrofale rozbijają wiązania wodorowe, głównie wytworzone pomiędzy cząsteczkami wody, a wyzwolona z wiązań energia powoduje bardzo szybkie i równomierne ogrzanie materiału. W efekcie dochodzi do denaturacji białek (w tym enzymatycznych) i zwiększenia przepuszczalności błon komórkowych. Jeżeli materiał jest zanurzony w utrwalaczu chemicznym, mikrofale wybitnie przyspieszają jego penetrację i proces tworzenia się wiązań krzyżowych.

3.3.6. Wypłukiwanie utrwalacza

W przypadku większości utrwalaczy określony jest maksymalny czas utrwalania. Przedłużenie tego czasu może spowodować niekorzystne zmiany strukturalne w komórkach i tkance. Dlatego też proces utrwalania przerywa się poprzez wypłukanie utrwalacza z materiału. W zależności od rodzaju planowanych badań mikroskopowych (rutynowa mikroskopia świetlna, histochemia, mikroskopia elektronowa) płukanie przeprowadza się bądź w wodzie (najlepiej bieżącej), bądź w buforach, które służyły uprzednio jako rozpuszczalnik dla utrwalacza. Jeżeli użyto alkoholowego (bezwodnego) roztworu utrwalacza, płukanie przeprowadza się w kilku zmianach alkoholu o nieco wyższym stężeniu.

3.4. Odwadnianie

Po utrwaleniu materiału, dalsze etapy procedury uzależnione są od rodzaju docelowego preparatu mikroskopowego. W przypadku rozmazów, rozgniotów czy hodowli, można od razu przystępować do barwienia. Jeżeli natomiast chcemy uzyskać skrawki o przydatnej w mikroskopii bardzo niewielkiej grubości, pokrojenie materiału jest możliwe jedynie pod warunkiem jego należytego utwardzenia. Im cieńsze mają być skrawki, tym twardszy musi być krojony materiał.

Utwardzenie można uzyskać poprzez zamrożenie materiału (technika mrożeniowa, p. rozdz. 5), albo poprzez przepojenie go odpowiednimi substancjami: parafiną, celoidyną lub polimeryzującymi żywicami (proces ten nosi nazwę zatapiania). Substancje, w których zatapiamy materiał mogą być polarne (czyli rozpuszczalne w wodzie) lub niepolarne (nierozpuszczalne w wodzie). Parafina, celoidyna, a także większość żywic to substancje niepolarne, stąd prawidłowe przepojenie tkanki podczas zatapiania wymaga uprzedniego usunięcia z niej wody.

W procesie odwadniania zastępujemy wodę obecną w tkance alkoholem lub acetonem. Proces ten polega na przeprowadzeniu materiału przez szereg wodnych roztworów tych substancji o stopniowo wzrastających stężeniach (np. 50, 70, 80, 90%) aż do dwóch zmian bezwodnego (absolutnego) alkoholu lub acetonu. Odwadniania dokonuje się w szczelnie zamkniętych naczyniach - jest to szczególnie istotne podczas ostatniego etapu tej procedury, gdyż zwłaszcza absolutny alkohol jest niezwykle higroskopijny i z łatwością chłonie wodę z powietrza.

3.5. Płyny pośrednie

Odwodnionego materiału zazwyczaj nadal nie można zatopić, gdyż substancja, którą chcemy go przepoić, nie rozpuszcza się również w alkoholu czy acetonie. Istnieje zatem konieczność wstępnego przepojenia tkanki płynem, który rozpuszczałby się zarówno w odwadniaczu, jak i w środowisku użytym do zatapiania. Płyny takie noszą nazwę płynów pośrednich, bowiem pośredniczą pomiędzy odwadnianiem a zatapianiem. Dopiero po dokładnym przepojeniu materiału płynem pośrednim można rozpocząć jego zatapianie.

W przypadkach, gdy materiał zatapia się w środowiskach polarnych, nie jest konieczne ani odwadnianie, ani przepajanie płynem pośrednim.

3.6. Zatapianie w parafinie

Płynami pośrednimi są tu rozpuszczalniki organiczne: benzen, toluen, ksylen, chloroform, itp. Używając parafiny do utwardzania materiału przed jego skrojeniem wykorzystuje się fakt, iż w temperaturze pokojowej parafina jest substancją stałą, natomiast po stosunkowo nieznacznym ogrzaniu przechodzi w stan płynny.

W pierwszym etapie umieszcza się materiał w roztworze płynu pośredniego i parafiny (1:1) w temperaturze 37°C. Pozwala to na wstępne wprowadzenie parafiny do tkanki. Następnie materiał przeprowadza się przez 2 lub 3 zmiany czystej parafiny, aby usunąć zeń nawet śladowe resztki płynu pośredniego, którego obecność wpłynęłaby niekorzystnie na własności materiału podczas krojenia.

W rutynowej technice histologicznej używa się kilku odmian parafiny różniących się twardością i temperaturą topnienia (im wyższa twardość, tym wyższa temperatura topnienia: od 45°C dla parafiny bardzo miękkiej do 60°C dla bardzo twardej). Proces przepajania parafiną odbywa się w cieplarce, w temperaturze o kilka stopni wyższej od temperatury topnienia użytej parafiny. Czas przepajania jest zależny od rodzaju tkanki (jej twardości, spoistości, itp.) oraz od rozmiarów zatapianego materiału i wynosi od kilku godzin do kilku dni.

Skonstruowano urządzenia (tzw. procesory tkankowe), w których cały proces od odwodnienia materiału do jego przepojenia parafiną odbywa się automatycznie. Są one wykorzystywane w pracowniach wykonujących szczególnie duże ilości preparatów mikroskopowych (np. duże pracownie histopatologiczne).

3.6.1. Formowanie bloczków

Po zakończeniu procesu zatapiania materiał wkłada się do specjalnych foremek, zalewa płynną parafiną i szybko oziębia, np. przez zanurzenie w zimnej wodzie. Parafina zestala się i tak uzyskany bloczek można następnie przyciąć do pożądanego kształtu i rozmiarów za pomocą ostrego noża.

Przy równoczesnym opracowywaniu większej ilości materiałów niezbędne jest odpowiednie oznakowanie bloczków. Najprościej można to zrobić przez włożenie do foremki niewielkiego paska papieru zawierającego symbol danego materiału w ten sposób, aby po zestaleniu parafiny oznakowany fragment paska wystawał poza bloczek.

3.6.2. Zalety i ograniczenia techniki parafinowej

Technika parafinowa jest najpowszechniej stosowaną procedurą przygotowania tkanek do rutynowych badań w mikroskopie świetlnym z uwagi na niskie koszty, możliwość uzyskania wystarczająco cienkich skrawków, skrawków seryjnych (p. dalej) oraz stosunkowo krótki czas trwania procedury (1‑3 dni od momentu pobrania materiału do otrzymania preparatów).

Technika ta posiada jednak istotne wady, do których należą:

· stosowanie wysokiej temperatury (50‑60°C), powodującej inaktywację enzymów i obkurczanie się niektórych tkanek;

· konieczność używania rozpuszczalników organicznych powodujących wypłukiwanie z materiału tłuszczów (lipidów);

· konieczność dodatkowego przygotowania skrawków do barwienia (p. dalej).

· kruszenie się i rozwarstwianie skrawków przy materiałach twardych lub o niejednorodnej strukturze;

· znaczne trudności przy krojeniu skrawków o dużej powierzchni.

3.7. Zatapianie w celoidynie

...